Цистеиновые протеазы в условиях различного микроокружения: биофизические, кинетические и структурно-функциональные свойства надмолекулярных комплексов

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-74-20053

НазваниеЦистеиновые протеазы в условиях различного микроокружения: биофизические, кинетические и структурно-функциональные свойства надмолекулярных комплексов

Руководитель Холявка Марина Геннадьевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" , Воронежская обл

Конкурс №51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-204 - Биофизика

Ключевые слова бромелин (КФ 3.4.22.4), фицин (КФ 3.4.22.3), папаин (КФ 3.4.22.2), иммобилизация, комплексообразование, биодеградируемые полисахариды, графт-сополимеры

Код ГРНТИ34.15.19

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Возможности применения ферментов в медицинских целях ограничены рядом причин: 1) они неустойчивы при хранении, а также при различных, особенно тепловых, воздействиях; 2) многократное или пролонгированное использование энзимов затруднено; 3) практически невозможно однозначно прогнозировать поведение энзима и кинетику реакции. Первую проблему можно решить путем стабилизации фермента субстратом или другими соединениями, ковалентной модификацией, например, гликозилированием, путем ассоциации молекул белка и получения его химически сшитых полимерных производных (это частный случай иммобилизации – сополимеризация молекул фермента). Все более популярным становится конструирование энзимов с заданными свойствами с помощью сайт-направленного мутагенеза. Вторую и третью проблемы чаще решают путем получения гетерогенных (нерастворимых в воде) ферментных препаратов с помощью различных методов комплексообразования и иммобилизации молекул белка на полимерных носителях – физической или химической (ковалентной). Целью проекта является создание стабильных надмолекулярных комплексов и гетерогенных ферментных препаратов на основе цистеиновых протеаз, иммобилизованных на матрице хитозана, карбоксиметилцеллюлозы, их производных и биодеградируемых графт-сополимеров для усиления эффективности антибиотиков в борьбе с микробными биопленками. Мы предлагаем использовать фицин, бромелин, папаин в комплексной терапии гнойных ран для разрыхления и разрушения бактериальных пленок, образование которых значительно замедляет процесс регенерации тканей. В ходе выполнения проекта будут предложены методики «зеленого» синтеза графт-сополимеров с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМА) или их сополимеров с 1-винил-3,5-диметилпиразолом, изучены механизмы комплексообразования и иммобилизации цистеиновых протеаз на их матрице, осуществлен поиск путей направленного изменения структурно-функциональных свойств фицина, бромелина, папаина, а также методов стабилизации белковых молекул для использования в медицине. Сочетание гидрофильных и гидрофобных свойств, обусловленных звеньями КМЦ, ВИ, ДМАЭМА и ВДМП соответственно, позволит улучшить связывание цистеиновых протеаз с макромолекулами графт-сополимеров. Кроме того, ожидается, что введение гидрофобных звеньев ВДМП в гидрофильную полимерную матрицу приведет к уменьшению размеров частиц сополимеров в водных растворах, что также важно при создании полимеров-носителей. Введение звеньев ДМАЭМА в макромолекулы сополимера обеспечит наличие стимул-чувствительности, что сможет повысить селективность доставки ферментов. Использование комплекса методов компьютерного и математического моделирования, взаимодополняющих биофизических методов и подходов (динамического светорассеяния, ИК-спектроскопии, рамановской спектроскопии, кругового дихроизма, ЯМР, атомно-силовой микроскопии, FRAP) для извлечения информации на молекулярном и супрамолекулярном уровнях структурной организации микродисперсных сред на основе гетерогенных (иммобилизованных) ферментных препаратов на фоне модификации этих систем различными лигандами; получение информации о локализации и микроокружении белковых макромолекул, структуре поверхности раздела фаз в микроэмульсиях; контроль вторичной структуры белков помогут расширить имеющиеся представления о молекулярных механизмах влияния микроокружения на функционирование цистеиновых протеаз в биосистемах и установить новые подходы к управлению функциональной активностью ферментов при образовании ими надмолекулярных комплексов. Полученные данные внесут вклад в решение фундаментальной проблемы энзимологии – продление времени полужизни ферментных препаратов, а также одной из задач современной медицины – снижение концентрации лекарственного средства в организме наряду с пролонгированием его действия. Ферментативный гидролиз матрикса биопленки представляет собой альтернативный подход к лечению инфекций для сокращения сроков микробной деконтаминации, восстановления тканей и заживления кожных покровов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Сорокин А, Суханов П., Попов В., Канныкин С., Лавлинская М. A new approach to increasing the equilibrium swelling ratio of the composite superabsorbents based on carboxymethyl cellulose sodium salt Cellulose, https://doi.org/10.1007/s10570-021-04326-3 (год публикации - 2021)
10.1007/s10570-021-04326-3

2. А.В. Сорокин, М.Г. Холявка, М.С. Лавлинская Синтез и свойства водных растворов графт-сополимеров хитозана и N-винилимидазола Конденсированные среды и межфазные границы, 23(4): 570–577 (год публикации - 2021)
10.17308/kcmf.2021.23/000

3. Ольшанникова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Получение комплексов папаина с микрочастицами хитозана и оценка их стабильности по уровню ферментативной активности Химико-фармацевтический журнал, № 11. С. 51-55. (год публикации - 2021)
10.30906/0023-1134-2021-55-11-51-55

4. Ольшанникова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Панкова С.М., Федорова О.А., Гродецкая Т.А., Евлаков П.М., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Использование комплексов фицина и микрочастиц хитозана в технологии клонального микроразмножения березы пушистой для снижения количества инфицированных эксплантов Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация, № 4. С. 45-51 (год публикации - 2021)

5. Ольшанникова С., Холявка М., Файзуллин Д., Королева В., Захартченко Н., Зуев Ю., Кондратьев М., Панкова С., Сакибаев Ф., Артюхов В. Structural incites in stability and activity of immobilized cysteine proteases by molecular docking and FTIR spectroscopy European Journal of Clinical Investigation, V. 51. Supplement 1. – P. 144-145 (год публикации - 2021)
10.1111/eci.13567

6. Ольшанникова С., Холявка М., Королева В., Сакибаев Ф., Артюхов В. Development of heterogeneous biocatalysts based on complexes of proteolytic enzymes and chitosan microparticles European Journal of Clinical Investigation, V. 51. Supplement 1. P. 146-147. (год публикации - 2021)
10.1111/eci.13567

7. Сакибаев Ф., Ольшанникова С., Королева В., Панкова С., Сорокин А., Лавлинская М., Холявка М., Артюхов В Development of a technique for the adsorption immobilization of papain on chitosan derivatives European Journal of Clinical Investigation, V. 51. Supplement 1. P. 148-149. (год публикации - 2021)
10.1111/eci.13567

8. Байдамшина Д.Р., Холявка М.Г., Тризна Е.Ю., Королева В.А., Ольшанникова С.М., Каюмов А.Р. Использование гидролитических ферментов для повышения эффективности терапии инфекций, ассоциированных с образованием бактериальной биопленки Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 26 - 29 ОКТЯБРЯ 2021 г, Москва, Выпуск 19. С. 82-84 (год публикации - 2021)
10.37747/2312-640X-2021-19

9. Сорокин А.В., Лавлинская М.С. Влияние строения полисахарида на степень набухания композитных суперабсорбентов Сборник трудов II всероссийской научной конференции (c международным участием) преподавателей и студентов вузов «актуальные проблемы науки о полимерах» 25 - 26 мая 2021 г, г. Казань, С. 15-16 (год публикации - 2021)

10. Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Редько Ю.А., Листишенкова Е.А., Холявка М.Г., Лавлинская М.С., Панкова С.М., Королева В.А., Артюхов В.Г Новые биокатализаторы на основе папаина и водорастворимых производных хитозана. III Школа-конференция для молодых ученых «Супрамолекулярные стратегии в химии, биологии и медицине: фундаментальные проблемы и перспективы» (с международным участием) (Казань, 2021), С. 140 (год публикации - 2021)

11. Ю.А. Редько, С.С. Ольшанникова, М.Г. Холявка, В.Г. Артюхов. Создание биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного ковалентным методом на хитозане. Сборник Тезисов IV Всероссийской с международным участием школы-конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии XXI века». Казань, С. 88 (год публикации - 2021)

12. Н. В. Малыхина, С.С. Ольшанникова, М. Г. Холявка, М. С. Лавлинская, А. В. Сорокин, В. Г. Артюхов. Разработка методики иммобилизации папаина на матрице производных хитозана. Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 74-й Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых, посвященной памяти проф. А.П. Веселова (Н. Новгород, 20–23 апреля 2021 г.)., С.141. (год публикации - 2021)

13. С. С. Ольшанникова, Ю. А. Редько, И.К. Воробьев, М. Г. Холявка, В. Г. Артюхов. Разработка гетерогенных биокатализаторов на основе фицина, иммобилизованного на матрицах хитозана разной молекулярной массы. Физико-химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах (ФАГРАН-2021): материалы IX Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения Я.А. Угая (г. Воронеж, 4–7 октября 2021 г.)., С. 506-508. (год публикации - 2021)

14. С.М. Панкова, М.Г. Холявка, В.Г. Артюхов. Возможности применения полимерной матрицы на основе сукцината хитозана в качестве фотопротектора протеаз Физико-химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах (ФАГРАН-2021): материалы IX Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения Я.А. Угая (г. Воронеж, 4–7 октября 2021 г.)., С. 508-510 (год публикации - 2021)

15. Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Юдин Н.Е., Вышкворкина Ю.М., Лукин А.Н., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Novel Immobilized Biocatalysts Based on Cysteine Proteases Bound to 2-(4-Acetamido-2-sulfanilamide) Chitosan and Research on Their Structural Features Polymers, 14:3223 (год публикации - 2022)
10.3390/polym14153223

16. Холявка М.Г., Гончарова С.С., Сорокин А.В., Лавлинская М.С., Редько Ю.А., Файзуллин Д.А., Байдамшина Д.Р., Зуев Ю.Ф., Кондратьев М.С., Каюмов А.Р., Артюхов В.Г. Novel Biocatalysts Based on Bromelain Immobilized on Functionalized Chitosans and Research on Their Structural Features Polymers, 14:5110 (год публикации - 2022)
10.3390/polym14235110

17. Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Файзуллин Д.А., Зуев Ю.Ф., Артюхов В.Г. Chitosan Graft Copolymers with N-Vinylimidazole as Promising Matrices for Immobilization of Bromelain, Ficin, and Papain Polymers, 14:2279 (год публикации - 2022)
10.3390/polym14112279

18. Редько Ю.А., Ольшанникова С.С., Холявка М.Г., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Артюхов В.Г. Development of a method for obtaining bromelain associates with chitosan micro- and nanoparticles Pharmaceutical Chemistry Journal, Vol. 56, No. 7. – P. 984-988 (год публикации - 2022)
10.1007/s11094-022-02737-5

19. Панкова С.М., Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. A Possible Role of Charged Amino-Acid Clusters on the Surface of Cysteine Proteases for Preserving Activity when Binding with Polymers Biophysics (Russian Federation), Т. 67, № 1. – С. 14-21. (год публикации - 2022)
10.1134/S0006350922010146

20. Холявка М.Г., Панкова С.М., Вышкворкина Ю.М., Лукин А.Н., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Chitosan as Photo Protector for Papain Immobilized on Its Matrix Biophysics (Russian Federation), Vol. 67, No. 3. – P. 365–373. (год публикации - 2022)
10.1134/S0006350922030095

21. Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г., Лавлинская М.С., Артюхов В.Г. Acyl-Modified Water-Soluble Chitosan Derivatives as Carriers for Adsorption Immobilization of Papain Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol. 48, No. 2. – P. 310–320 (год публикации - 2022)
10.1134/S1068162022020212

22. Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Разработка биокатализатора на основе папаина, стабилизированного в комплексах с хитозаном и его производными: карбоксиметилхитозаном и N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозаном Биотехнология, Т. 38. – № 1. – С. 39-46 (год публикации - 2022)
10.56304/S0234275822010057

23. Холявка М.Г., Панкова С.М., Вышкворкина Ю.М., Лукин А.Н., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Хитозан и сукцинат хитозана как фотопротекторы для иммобилизованного на их матрице папаина Радиационная биология. Радиоэкология, Т. 62, № 5. – С. 532–542 (год публикации - 2022)
10.31857/S086980312205006X

24. Королева В.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Протеолитическая активность фицина и эффективность его иммобилизации в условиях варьирования ионной силы буфера Вестник ВГУ. Серия «Химия. Биология. Фармация»., № 2. – С. 38-43. (год публикации - 2022)

25. Панкова С.М., Байдамшина Д.Р., Холявка М.Г., Каюмов А.Р., Артюхов В.Г. Сочетанное действие УФ-излучения и некоторых протеолитических ферментов на бактерии в составе биопленок Биофармацевтический журнал, Т. 14, № 1. – С. 8-11 (год публикации - 2022)
10.30906/2073-8099-2022-14-1-8-11

26. Холявка М.Г., Ковалева И.Ю., Бруева М.С., Богомолов Д.Ю., Панкова С.М., Королева В.А., Артюхов В.Г. In silico анализ особенностей пространственной организации молекул целлюлаз из различных продуцентов Актуальные вопросы биологической физики и химии, Т. 7, № 1. – С. 137-146 (год публикации - 2022)
10.29039/rusjbpc.2022.0495

27. А.В. Сорокин, С.С. Ольшанникова, М.С. Лавлинская, М.Г. Холявка, В.Г. Артюхов Стабилизация активности бромелина, папаина и фицина путем их комплексообразования с графт-сополимерами хитозана и N-винилимидазола Актуальная биотехнология, № 1. – С. 32 (год публикации - 2022)

28. М.С. Лавлинская, А.В. Сорокин, С.С. Ольшанникова, М.Г. Холявка, В.Г. Артюхов Новые протеолитические ферментные препараты на основе бромелина, фицина и папаина и 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламид) хитозана Актуальная биотехнология, № 1. – С. 240 (год публикации - 2022)

29. М.Г. Холявка, С.М. Панкова, С.С. Ольшанникова, В.А. Королева, В.Г. Артюхов Влияние УФ-излучения в присутствии метиленового синего на процессы фотомодуляции ферментативной активности папаина, фицина, бромелина, свободных и иммобилизованных на матрице хитозана Актуальная биотехнология, № 1. – С. 256 (год публикации - 2022)

30. Ольшанникова С., Холявка М., Королева В., Панкова С., Дубовицкая А., Беляева Т., Редько Ю., Малыхина Н., Богомолов Д., Пайметьева Д., Артюхов В. Kinetics of ficin molecules aggregation by dynamic light scattering European Journal of Clinical Investigation, V. 52. Supplement 1. – P. 90. (год публикации - 2022)
10.1111/eci.13796

31. Ольшанникова С., Холявка М., Королева В., Панкова С., Дубовицкая А., Беляева Т., Редько Ю., Малыхина Н., Богомолов Д., Пайметьева Д., Артюхов В. Kinetics of papain molecules aggregation by dynamic light scattering European Journal of Clinical Investigation, V. 52. Supplement 1. – P. 91 (год публикации - 2022)
10.1111/eci.13796

32. Ольшанникова С., Холявка М., Королева В., Панкова С., Дубовицкая А., Беляева Т., Редько Ю., Малыхина Н., Богомолов Д., Пайметьева Д., Артюхов В. Kinetics of bromelain molecules aggregation by dynamic light scattering European Journal of Clinical Investigation, V. 52. Supplement 1. – P. 91-92. (год публикации - 2022)
10.1111/eci.13796

33. Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Холявка М.Г., Юдин Н.Е., Артюхов В.Г. Стабилизация протеолитической активности папаина путем создания наноразмерных гибридных препаратов Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2022: материалы XVII международной научной конференции, С. 143 (год публикации - 2022)

34. Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Юдин Н.Е., Артюхов В.Г. Стабилизация активности бромелина, папаина и фицина путем их комплексообразования с графт-сополимерами натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и N-винилимидазола Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2022: материалы XVII международной научной конференции, С. 172-173 (год публикации - 2022)

35. Холявка М.Г., Панкова С.М., Ольшанникова С.С., Королева В.А., Артюхов В.Г. Влияние УФ-излучения на удельную активность свободных и иммобилизованных путем адсорбции и включения в гели протеолитических ферментов Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2022: материалы XVII международной научной конференции, С. 183 (год публикации - 2022)

36. Сорокин А.В., Гончарова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Образование комплекса бромелина, папаина и фицина и графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы и N-винилимидазола повышает активность цистеиновых протеаз Книга тезисов школы-конференции для молодых ученых «Самоорганизация в «мягких» средах: достижения и современное состояние», С. 58 (год публикации - 2022)

37. Холявка М.Г., Панкова С.М., Артюхов В.Г. Гели хитозана и сукцината хитозана как фотопротекторы для трипсина Книга тезисов школы-конференции для молодых ученых «Самоорганизация в «мягких» средах: достижения и современное состояние», С. 77 (год публикации - 2022)

38. Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Гончарова С.С., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Повышение удельной протеолитической активности фицина путем его конъюгирования с карбоксиметилцеллюлозой и ее производными Книга тезисов школы-конференции для молодых ученых «Самоорганизация в «мягких» средах: достижения и современное состояние», С. 78 (год публикации - 2022)

39. Д.Р. Байдамшина, С.С. Гончарова, М.Г. Холявка, А.Р. Каюмов Оценка способности бромелина иммобилизованного на водорастворимых производных хитозана разрушать бактериальные биопленки V Всероссийская с международным участием школа-конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии XXI века». Сборник тезисов, С. 12 (год публикации - 2022)

40. Гончарова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Биокатализаторы на основе ассоциатов папаина с наночастицами хитозана Конденсированные среды и межфазные границы, Т. 25, №2. С. 173-181. (год публикации - 2023)

41. Сорокин А.В., Гончарова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Зуев Ю.Ф., Файзуллин Д.А., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Исследование механизма взаимодействия фицина с графт-сополимером натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и N-винилимидазола методами молекулярного докинга, инфракрасной спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния Биофизика, Т. 68, № 2. С. 248-256 (год публикации - 2023)

42. Сорокин А.В., Гончарова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Файзуллин Д.А., Зуев Ю.Ф., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Complexation of Bromelain, Ficin, and Papain with the Graft Copolymer of Carboxymethyl Cellulose Sodium Salt and N-Vinylimidazole Enhances Enzyme Proteolytic Activity International Journal of Molecular Sciences, Vol. 24, No 14, Article Number 11246 (год публикации - 2023)

43. Холявка М.Г., Гончарова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Артюхов В.Г. Novel biocatalysts based on enzymes in complexes with nano and micromaterials Biophysical Reviews, V. 15. P. 1127–1158 (год публикации - 2023)

44. Байдамшина Д.Р., Тризна Е.Ю., Гончарова С.С., Сорокин А.В., Лавлинская М.С., Мельник А.П., Гафарова Л.Ф., Харитонова М.А., Остолоповская О.В., Артюхов В.Г., Соколова Е.А., Холявка М.Г., Богачев М.И., Каюмов А.Р., Зеленихин П.В. The Effect of Ficin Immobilized on Carboxymethyl Chitosan on Biofilms of Oral Pathogens International Journal of Molecular Sciences, Vol. 24. Article Number 16090 (год публикации - 2023)

45. Сорокин А.В., Гончарова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Файзуллин Д.А., Кондратьев М.С., Канныкин С.В., Зуев Ю.Ф., Артюхов В.Г. Carboxymethyl Cellulose-Based Polymers as Promising Matrices for Ficin Immobilization Polymers, Vol.15, Article Number 649 (год публикации - 2023)
10.3390/polym15030649

46. Малыхина Н.В., Ольшанникова С.С., Холявка М.Г., Сорокин А.В., Лавлинская М.С., Артюхов В.Г., Файзуллин Д.А., Зуев Ю.Ф. Получение комплексов фицина с карбоксиметилхитозаном и N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозаном и изучение их структурных особенностей Биоорганическая химия, Т. 49, № 1. С. 93-104 (год публикации - 2023)

47. Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Гончарова С.С., Кондратьев М.С., Михайлова А.А., Кузнецов Е.И., Балбеков Н.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Исследование особенностей взаимодействия поверхности бромелина и карбоксиметилцеллюлозы в процессе их адсорбционной иммобилизации Сорбционные и хроматографические процессы, Т. 24, № 3. – С. 403-414 (год публикации - 2024)
10.17308/sorpchrom.2024.24/12242

48. Редько Ю. А., Гончарова С. С., Холявка М. Г., Лавлинская М. С., Михайлова А. А., Сорокин А. В., Кондратьев М. С., Артюхов В. Г. Разработка методики получения ассоциатов бромелина с микро- и наночастицами карбоксиметилхитозана Сорбционные и хроматографические процессы, Т. 24, № 5. – С. 795-805 (год публикации - 2024)
10.17308/sorpchrom.2024.24/12518

49. Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Гончарова С.С., Холявка М.Г., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Structural and Functional Features of Protein–Polysaccharide Complexes Based on Cysteine Proteases and Hydrophilically Modified Chitosan Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Т. 50, № 5. – С. 609–618 (год публикации - 2024)
10.1134/S1068162024050261

50. Редько Ю.А., Гончарова С.С., Холявка М.Г., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Михайлова А.А., Артюхов В.Г. Разработка методики получения ассоциатов фицина с микро- и наночастицами карбоксиметилхитозана Химико-фармацевтический журнал, Т. 58. – № 8. – С. 37-43 (год публикации - 2024)
10.30906/0023-1134-2024-58-8-37-43

51. Холявка М.Г., Гончарова С.С., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Novel Hybrid Catalysts of Cysteine Proteases Enhanced by Chitosan and Carboxymethyl Chitosan Micro- and Nanoparticles Polymers, V. 16:3111 (год публикации - 2024)
10.3390/polym16223111

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Осуществлен сравнительный анализ особенностей структуры и динамического поведения димеров молекул цистеиновых протеаз in silico (на примере папаина, бромелина и фицина) в среде различной полярности и ионного состава при различных температурах. Выявлены общие закономерности, а также индивидуальные особенности их поведения молекул папаиноподобных протеаз. Компьютерные расчеты, выполненные методом молекулярного докинга и молекулярной динамики, показали, что димеры ферментов могут проявлять каталитическую активность, характеризоваться высокой термостабильностью, а при повышенных температурах будут проявлять тенденцию к компактизации. В экспериментах in vitro выявлены взаимосвязи между процессами термической инактивации, денатурации и агрегации молекул папаиноподобных протеаз. Установлено, что кривые термоинактивации фицина, бромелина и папаина при 60, 70 и 80 °C демонстрируют две стадии: начальная стадия (время инкубации менее 10 минут), характеризующаяся быстрым снижением каталитической активности, за которой следует вторая стадия (время инкубации от 10 до 60 минут), характеризующаяся стабилизацией остаточной активности фермента. Наличие излома и двухфазный характер кривой термоинактивации цистеиновых протеаз могут свидетельствовать о последовательном развитии как минимум двух стадий в этом сложном процессе или о существовании в системе двух форм фермента с различной устойчивостью к денатурирующим воздействиям (потенциально возникающих в результате частичного автолиза или частичной агрегации). Установлено, что агрегированные молекулы фермента сохраняют остаточную активность. Сделан вывод о том, что начальная стадия термической инактивации цистеиновых протеаз протекает значительно быстрее, чем термическая денатурация фермента. Изучена кинетика агрегации фицина, бромелина и папаина. На основании полученных нами результатов можно с высокой степенью вероятности предположить, что денатурация и агрегация молекул цистеиновых протеаз способствуют потере их активности, но только частично. Необратимая денатурация активной и неактивной форм характеризуется одинаковой константой скорости денатурации. Следовательно, мы наблюдаем более высокую скорость инактивации фермента по сравнению со скоростью денатурации. Кроме того, за процессом инактивации следуют процессы агрегация белка. Частичная агрегация ферментов начинается в течение первых нескольких минут инкубации, и с увеличением температуры и продолжительности нагревания доля агрегатов в системе также увеличивается. Размеры как активных, так и неактивных форм схожи, и денатурация этих форм происходит примерно с одинаковой скоростью. В частности, необратимая денатурация активных и неактивных форм характеризуется одинаковой константой скорости денатурации. Для изучения факторов, управляющих структурными свойствами и функциональной активностью цистеиновых протеаз, мы применили методы кругового дихроизма, ИК и КР-спектроскопии. Была изучена вторичная структура папаина в комплексе с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ). Различия между результатами, полученными методами КД и ИК-спектроскопии были наиболее выражены при расчете доли α-спиральных участков молекулы папаина существенно в меньшей степени – при расчете доли β-складчатостей и неупорядоченных участков. С использованием функции Nonlinear Model Fit пакета Mathematica созданы математические модели зависимости активности свободных и иммобилизованных на матрицах хитозана и его производных фицина, бромелина, папаина от значений температуры, рН-среды, концентрации субстрата. С целью изучения перспектив сочетанного действия цистеиновых протеаз и антибиотиков для разрушения бактериальных биопленок была нами была выявлена зависимость активности фицина от концентрации ряда антибиотиков. Показано, что такие антибиотики, как метронидазол, флорфеникол, цефтриаксон, амоксицилин, левомицетин, норсульфазол и фуразомидол можно применять совместно с фицином в борьбе против биопленок. Нами был накоплен массив экспериментальных данных и осуществлен теоретический анализ особенностей взаимодействия молекул папаиноподобных цистеиновых протеаз с функционально активными группами хитозана его производных и графт-сополимеров с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы или хитозана с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола или N,N-диметиламиноэтилметакрилата. Результаты молекулярного докинга и молекулярной динамики сопоставлены с данными эксперимента in vitro, в частности с результатами ИК-спектроскопии. Установлено, что взаимодействие цистеиновых протеаз – бромелина, папаина и фицина – с природными и модифицированными полисахаридами протекает самопроизвольно: образуются комплексы, в которых полисахариды расположены в непосредственной близости от каталитического кармана ферментов. Иммобилизация на названых типах носителей вызывает изменения нативной конформации молекул цистеиновых протеаз, которые чаще проявляются в снижении доли α-спиральных участков и увеличении числа β-структур. Подобраны условия для управляемой (порционной) десорбции фицина, папаина, бромелина из комплексов с носителями путем варьирования состава микроокружения фермента. Комплекс фицина с водорастворимы производным хитозана – 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламид)хитозаном (САХТЗ), как самый перспективный (на основе предыдущих экспериментов) среди полученных нами других комплексов фермент-носитель был апробирован на моделях повреждения кожи у крыс с заражением клетками стафилококка и последующим анализом микробной обсемененности и времени заживления раны. Показано, что обработка ран фицином в растворимой или иммобилизованной форме, а также САХТЗ значительно ускоряет их заживление и усиливает микробную деконтаминацию Таким образом, в ходе проделанной работы было выявлено, что САХТЗ обладает антимикробной активностью, не имеет цитотоксического эффекта, а также в иммобилизованной форме с фицином способствует заживлению и очищению ран.

Публикации