КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 21-74-20053

НазваниеЦистеиновые протеазы в условиях различного микроокружения: биофизические, кинетические и структурно-функциональные свойства надмолекулярных комплексов

РуководительХолявка Марина Геннадьевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет", Воронежская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

2021 г. - 2024 г.

Конкурс№51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Объект инфраструктуры Коллективный спектро-аналитический Центр изучения строения, состава и свойств веществ и материалов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра «Казанского научного центра Российской академии наук».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-204 - Биофизика

Ключевые словабромелин (КФ 3.4.22.4), фицин (КФ 3.4.22.3), папаин (КФ 3.4.22.2), иммобилизация, комплексообразование, биодеградируемые полисахариды, графт-сополимеры

Код ГРНТИ34.15.19

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Возможности применения ферментов в медицинских целях ограничены рядом причин: 1) они неустойчивы при хранении, а также при различных, особенно тепловых, воздействиях; 2) многократное или пролонгированное использование энзимов затруднено; 3) практически невозможно однозначно прогнозировать поведение энзима и кинетику реакции. Первую проблему можно решить путем стабилизации фермента субстратом или другими соединениями, ковалентной модификацией, например, гликозилированием, путем ассоциации молекул белка и получения его химически сшитых полимерных производных (это частный случай иммобилизации – сополимеризация молекул фермента). Все более популярным становится конструирование энзимов с заданными свойствами с помощью сайт-направленного мутагенеза. Вторую и третью проблемы чаще решают путем получения гетерогенных (нерастворимых в воде) ферментных препаратов с помощью различных методов комплексообразования и иммобилизации молекул белка на полимерных носителях – физической или химической (ковалентной). Целью проекта является создание стабильных надмолекулярных комплексов и гетерогенных ферментных препаратов на основе цистеиновых протеаз, иммобилизованных на матрице хитозана, карбоксиметилцеллюлозы, их производных и биодеградируемых графт-сополимеров для усиления эффективности антибиотиков в борьбе с микробными биопленками. Мы предлагаем использовать фицин, бромелин, папаин в комплексной терапии гнойных ран для разрыхления и разрушения бактериальных пленок, образование которых значительно замедляет процесс регенерации тканей. В ходе выполнения проекта будут предложены методики «зеленого» синтеза графт-сополимеров с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМА) или их сополимеров с 1-винил-3,5-диметилпиразолом, изучены механизмы комплексообразования и иммобилизации цистеиновых протеаз на их матрице, осуществлен поиск путей направленного изменения структурно-функциональных свойств фицина, бромелина, папаина, а также методов стабилизации белковых молекул для использования в медицине. Сочетание гидрофильных и гидрофобных свойств, обусловленных звеньями КМЦ, ВИ, ДМАЭМА и ВДМП соответственно, позволит улучшить связывание цистеиновых протеаз с макромолекулами графт-сополимеров. Кроме того, ожидается, что введение гидрофобных звеньев ВДМП в гидрофильную полимерную матрицу приведет к уменьшению размеров частиц сополимеров в водных растворах, что также важно при создании полимеров-носителей. Введение звеньев ДМАЭМА в макромолекулы сополимера обеспечит наличие стимул-чувствительности, что сможет повысить селективность доставки ферментов. Использование комплекса методов компьютерного и математического моделирования, взаимодополняющих биофизических методов и подходов (динамического светорассеяния, ИК-спектроскопии, рамановской спектроскопии, кругового дихроизма, ЯМР, атомно-силовой микроскопии, FRAP) для извлечения информации на молекулярном и супрамолекулярном уровнях структурной организации микродисперсных сред на основе гетерогенных (иммобилизованных) ферментных препаратов на фоне модификации этих систем различными лигандами; получение информации о локализации и микроокружении белковых макромолекул, структуре поверхности раздела фаз в микроэмульсиях; контроль вторичной структуры белков помогут расширить имеющиеся представления о молекулярных механизмах влияния микроокружения на функционирование цистеиновых протеаз в биосистемах и установить новые подходы к управлению функциональной активностью ферментов при образовании ими надмолекулярных комплексов. Полученные данные внесут вклад в решение фундаментальной проблемы энзимологии – продление времени полужизни ферментных препаратов, а также одной из задач современной медицины – снижение концентрации лекарственного средства в организме наряду с пролонгированием его действия. Ферментативный гидролиз матрикса биопленки представляет собой альтернативный подход к лечению инфекций для сокращения сроков микробной деконтаминации, восстановления тканей и заживления кожных покровов.

Ожидаемые результаты
Мы планируем установить механизмы функционирования ряда иммобилизованных протеаз с помощью современных биофизических методов (динамического светорассеяния, ИК-спектроскопии, рамановской спектроскопии, кругового дихроизма, ЯМР, атомно-силовой микроскопии, FRAP), классических подходов энзиматического анализа, методов компьютерного и математического моделирования. Будут исследованы структурно-функциональные характеристики гетерогенных ферментных препаратов и надмолекулярных комплексов бромелина, фицина, папаина, составлены прогнозы относительно степени их варьирования под влиянием различных физико-химических факторов и предложены способы целенаправленного изменения свойств ферментных препаратов. Рыночный спрос на гомологи хитозана и карбоксиметилцеллюлозы с пониженной молекулярной массой определил развитие поисковых научных работ по созданию рациональных способов их модификации с целью повышения аффинности к различным фармацевтическим препаратам. Расширяются направления исследований по синтезу комплексных соединений на основе хитозана, карбоксиметилцеллюлозы и их аналогов с низкомолекулярными соединениями и полимерами. Получили приоритет работы по комплексообразованию хитозана и карбоксиметилцеллюлозы с ферментами в целях модификации их свойств. Исходя из наших собственных результатов и базируясь на литературных данных, мы планируем предложить схему процессов иммобилизации фицина, папаина, бромелина на хитозанах различной молекулярной массы, их производных (карбоксиметилхитозане, ацетате хитозана, хлорид гидроксипропилтриметил аммоний хитозане, N-малеоилхитозане, N-сукциноилхитозане, 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламид)хитозане, сульфате хитозана), карбоксиметилцеллюлозе, а также на графт-сополимерах: КМЦ-ВИ; КМЦ-ДМАЭМА; ХТЗ-ВИ; ХТЗ-ДМАЭМА; КМЦ-ВИ-ВДМП; КМЦ-ДМАЭМА-ВДМП; ХТЗ-ВИ-ВДМП; ХТЗ-ДМАЭМА-ВДМП с различным содержанием звеньев виниловых сомономеров. C помощью современных методов компьютерного моделирования на поверхности белковых глобул ферментов будут выявлены участки, перспективные для связывания с подложками или их фрагментами. Будет изучен ряд биодеградируемых полисахаридов, в том числе модифицированных виниловыми мономерами. Это позволит эффективно провести виртуальный скрининг кандидатов в иммобилизационные агенты и, впоследствии, экспериментально проверить предложенные полимеры на предмет связывания с молекулами протеаз, а также оценить влияние таких взаимодействий на активность ферментов. Комплексы на основе растительных цистеиновых протеаз (фицина, бромелина, папаина) будут созданы путем их иммобилизации: адсорбция, включение в гели, пленки, связывание с микро- и наночастицами, сополимеризация. Для каждого фермента методика иммобилизации будет доработана и оптимизирована для достижения возможности его контролируемой обратимой диссоциации в жидкую фазу при антибактериальной терапии. Далее мы изучим структурно-функциональные свойства некоторых цистеиновых протеаз в условиях различного микроокружения (при образовании надмолекулярных комплексов и иммобилизации на полимерных носителях – хитозанах различной молекулярной массы, карбоксимелитцеллюлозе, их производных, а также графт-сополимерах). Будут проанализированы характер и степень изменения этих свойств у гетерогенных препаратов по сравнению с растворимыми ферментами. Далее мы планируем составить прогнозы относительно степени изменения характеристик ферментных препаратов при действии различных физико-химических факторов. Будут выявлены типы взаимодействий между белковой глобулой и функционально активными группами носителей, установлены молекулярные механизмы взаимодействия протеаз с матрицей нерастворимых полимеров. На основе экспериментальных данных будет разработана технология создания гетерогенных ферментных препаратов медицинского назначения и получены их лабораторные образцы. Для препаратов иммобилизованных протеиназ с наиболее привлекательными свойствами будет исследована возможность их использования в медицинских и ветеринарных целях для очищения ран, снижения скорости размножения бактерий (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcessens и др.) и образования ими биопленок. Апробация полученных препаратов будет проводиться на моделях повреждения кожи у крыс с заражением бактериальными клетками и без них и последующим анализом микробной обсемененности, гистологическим анализом ткани и времени заживления раны.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Сравнительный анализ результатов гибкого молекулярного докинга позволил предположить, что по сочетанию таких показателей, как величина сродства (ккал/моль) лиганда к рецептору и локализации оптимального места связывания лиганда наиболее эффективными и универсальными (пригодными сразу для всех трёх изученных протеаз: папаина, бромелина, фицина) агентами для иммобилизации могут выступать 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламид)хитозан, ацетат хитозана и сульфат-хитозана. Из графт-сополимеров наиболее перспективными лигандами являются ХТЗ-ВИ и ХТЗ-ВИ-ВДМП. Разработаны методики иммобилизации фицина, бромелина, папаина путем их адсорбции, включения в гели, комплексообразования. Процедура иммобилизации оптимизирована для достижения возможности контролируемой обратимой диссоциации (порционного высвобождения) фермента при антибактериальной терапии. Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) выявлено при иммобилизации названных цистеиновых протеаз на 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламид) хитозане с молекулярной массой 350 кДа. С помощью методов ИК-спектроскопии и рамановской спектроскопии доказано, что комплексы между молекулами цистеиновых протеаз и предлагаемыми нами носителями успешно формируются в ходе иммобилизации ферментов. Установлено, что водородные связи и электростатические взаимодействия являются ключевыми в процессе иммобилизации молекул фицина, папаина, бромелина на изучаемых нами полисахаридах. В ходе проделанной работы было выявлено, что протеолитические ферменты фицин, папаин и бромелин эффективно разрушают бактериальные биопленки, образованные клетками Staphylococcus aureus ATCC, Staphylococcus aureus 18 и 26 MSSA, Pseudomonas aeruginosa ATCC и Pseudomonas aeruginosa 1945 clinical isolate. Показано, что хитозаны и их производные приводят нарушению дыхательной функции клеток, в результате чего наблюдалась их частичная гибель при высоких концентрациях за исключением карбоксиметилхитозана 200 кДа

Публикации

1. А.В. Сорокин, М.Г. Холявка, М.С. Лавлинская Синтез и свойства водных растворов графт-сополимеров хитозана и N-винилимидазола Конденсированные среды и межфазные границы, 23(4): 570–577 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.17308/kcmf.2021.23/000

2. Ольшанникова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Панкова С.М., Федорова О.А., Гродецкая Т.А., Евлаков П.М., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Использование комплексов фицина и микрочастиц хитозана в технологии клонального микроразмножения березы пушистой для снижения количества инфицированных эксплантов Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация, № 4. С. 45-51 (год публикации - 2021)

3. Ольшанникова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Получение комплексов папаина с микрочастицами хитозана и оценка их стабильности по уровню ферментативной активности Химико-фармацевтический журнал, № 11. С. 51-55. (год публикации - 2021) https://doi.org/10.30906/0023-1134-2021-55-11-51-55

4. Сорокин А, Суханов П., Попов В., Канныкин С., Лавлинская М. A new approach to increasing the equilibrium swelling ratio of the composite superabsorbents based on carboxymethyl cellulose sodium salt Cellulose, https://doi.org/10.1007/s10570-021-04326-3 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1007/s10570-021-04326-3

5. Байдамшина Д.Р., Холявка М.Г., Тризна Е.Ю., Королева В.А., Ольшанникова С.М., Каюмов А.Р. Использование гидролитических ферментов для повышения эффективности терапии инфекций, ассоциированных с образованием бактериальной биопленки Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 26 - 29 ОКТЯБРЯ 2021 г, Москва, Выпуск 19. С. 82-84 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.37747/2312-640X-2021-19

6. Н. В. Малыхина, С.С. Ольшанникова, М. Г. Холявка, М. С. Лавлинская, А. В. Сорокин, В. Г. Артюхов. Разработка методики иммобилизации папаина на матрице производных хитозана. Биосистемы: организация, поведение, управление: Тезисы докладов 74-й Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых, посвященной памяти проф. А.П. Веселова (Н. Новгород, 20–23 апреля 2021 г.)., С.141. (год публикации - 2021)

7. Ольшанникова С., Холявка М., Королева В., Сакибаев Ф., Артюхов В. Development of heterogeneous biocatalysts based on complexes of proteolytic enzymes and chitosan microparticles European Journal of Clinical Investigation, V. 51. Supplement 1. P. 146-147. (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1111/eci.13567

8. Ольшанникова С., Холявка М., Файзуллин Д., Королева В., Захартченко Н., Зуев Ю., Кондратьев М., Панкова С., Сакибаев Ф., Артюхов В. Structural incites in stability and activity of immobilized cysteine proteases by molecular docking and FTIR spectroscopy European Journal of Clinical Investigation, V. 51. Supplement 1. – P. 144-145 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1111/eci.13567

9. С. С. Ольшанникова, Ю. А. Редько, И.К. Воробьев, М. Г. Холявка, В. Г. Артюхов. Разработка гетерогенных биокатализаторов на основе фицина, иммобилизованного на матрицах хитозана разной молекулярной массы. Физико-химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах (ФАГРАН-2021): материалы IX Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения Я.А. Угая (г. Воронеж, 4–7 октября 2021 г.)., С. 506-508. (год публикации - 2021)

10. С.М. Панкова, М.Г. Холявка, В.Г. Артюхов. Возможности применения полимерной матрицы на основе сукцината хитозана в качестве фотопротектора протеаз Физико-химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах (ФАГРАН-2021): материалы IX Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения Я.А. Угая (г. Воронеж, 4–7 октября 2021 г.)., С. 508-510 (год публикации - 2021)

11. Сакибаев Ф., Ольшанникова С., Королева В., Панкова С., Сорокин А., Лавлинская М., Холявка М., Артюхов В Development of a technique for the adsorption immobilization of papain on chitosan derivatives European Journal of Clinical Investigation, V. 51. Supplement 1. P. 148-149. (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1111/eci.13567

12. Сорокин А.В., Лавлинская М.С. Влияние строения полисахарида на степень набухания композитных суперабсорбентов Сборник трудов II всероссийской научной конференции (c международным участием) преподавателей и студентов вузов «актуальные проблемы науки о полимерах» 25 - 26 мая 2021 г, г. Казань, С. 15-16 (год публикации - 2021)

13. Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Редько Ю.А., Листишенкова Е.А., Холявка М.Г., Лавлинская М.С., Панкова С.М., Королева В.А., Артюхов В.Г Новые биокатализаторы на основе папаина и водорастворимых производных хитозана. III Школа-конференция для молодых ученых «Супрамолекулярные стратегии в химии, биологии и медицине: фундаментальные проблемы и перспективы» (с международным участием) (Казань, 2021), С. 140 (год публикации - 2021)

14. Ю.А. Редько, С.С. Ольшанникова, М.Г. Холявка, В.Г. Артюхов. Создание биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного ковалентным методом на хитозане. Сборник Тезисов IV Всероссийской с международным участием школы-конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии XXI века». Казань, С. 88 (год публикации - 2021)

15. Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г Программа для систематизации типов связей и взаимодействий белков с их лигандами -, Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2021665065 (год публикации - )

16. Холявка М.Г., Артюхов В.Г., Панкова С.М. Способ получения гетерогенного ферментного препарата на основе фицина и низкомолекулярного хитозана -, Заявка № 2021115149 (год публикации - )

17. Холявка М.Г., Ольшанникова С.С., Артюхов Способ получения гетерогенного препарата в геле на основе фицина и карбоксиметилцеллюлозы -, Заявка № 2021124260 (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Сравнительный анализ результатов каскадного (последовательного) для связывания хитозана, его производных, карбоксиметилцеллюлозы, графт-сополимеров хитозана и карбоксиметилцеллюлозы с N-винилимидазолом и N,N-диметиламиноэтилметакрилатом с молекулами цистеиновых протеаз (фицина, папаина, бромелина) показал, что наиболее стабильный комплекс с глобулами ферментов образовали такие производные хитозана, как 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламид)хитозан, ацетат хитозана и сульфат хитозана, тогда как другие модификации носителя и графт-сополимеры продемонстрировали снижение сродства лиганда к молекуле белка. Добавление в систему еще четырех молекул лигадов кардинальным образом не изменяло картину связывания, но в разных случаях приводило либо к распределению лигандов по поверхности глобулы, либо к формированию «шапочки» – скоплению молекул лиганда в области наиболее выгодного (первого) места связывания с поверхностью фермента. Разработаны методики получения ферментных препаратов на основе фицина, бромелина, папаина путем их иммобилизации комплексообразованием с микро- и наночастицами носителей и сополимеризацией. Для каждого фермента методика иммобилизации была оптимизирована для достижения возможности его контролируемой обратимой диссоциации. Установлено, что при сополимеризации фицина и бромелина оптимальная концентрация глутарового альдегида составляет 1%, для папаина – 5 %. Наиболее интересные результаты были достигнуты при комплексообразовании цистеиновых протеаз с микро- и наночастицами карбоксиметилхитозана, которое приводило к гиперактивации фицина, папаина и бромелина. Методом динамического рассеяния света изучены особенности агрегации фицина, папаина и бромелина в растворе при 50, 60, 70 и 80 °C. Методом ЯМР диффузометрии и релаксометрии охарактеризовано гидродинамическое поведение фицина, папаина и бромелина в растворе в зависимости от свойств микроокружения, оценены размеры пор в системах на основе хитозана. Осуществлен анализ влияния хитозанов и их производных на гидродинамические взаимодействия и трансляционную диффузию цистеиновых протеаз. Подобрана и оптимизирована с учетом особенностей образцов (гели и вязкие растворы) методика для анализа токсических свойств иммобилизованных ферментов.

Публикации

1. Королева В.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Протеолитическая активность фицина и эффективность его иммобилизации в условиях варьирования ионной силы буфера Вестник ВГУ. Серия «Химия. Биология. Фармация»., № 2. – С. 38-43. (год публикации - 2022)

2. Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Разработка биокатализатора на основе папаина, стабилизированного в комплексах с хитозаном и его производными: карбоксиметилхитозаном и N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозаном Биотехнология, Т. 38. – № 1. – С. 39-46 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.56304/S0234275822010057

3. Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Юдин Н.Е., Вышкворкина Ю.М., Лукин А.Н., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Novel Immobilized Biocatalysts Based on Cysteine Proteases Bound to 2-(4-Acetamido-2-sulfanilamide) Chitosan and Research on Their Structural Features Polymers, 14:3223 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/polym14153223

4. Панкова С.М., Байдамшина Д.Р., Холявка М.Г., Каюмов А.Р., Артюхов В.Г. Сочетанное действие УФ-излучения и некоторых протеолитических ферментов на бактерии в составе биопленок Биофармацевтический журнал, Т. 14, № 1. – С. 8-11 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.30906/2073-8099-2022-14-1-8-11

5. Панкова С.М., Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. A Possible Role of Charged Amino-Acid Clusters on the Surface of Cysteine Proteases for Preserving Activity when Binding with Polymers Biophysics (Russian Federation), Т. 67, № 1. – С. 14-21. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1134/S0006350922010146

6. Редько Ю.А., Ольшанникова С.С., Холявка М.Г., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Артюхов В.Г. Development of a method for obtaining bromelain associates with chitosan micro- and nanoparticles Pharmaceutical Chemistry Journal, Vol. 56, No. 7. – P. 984-988 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1007/s11094-022-02737-5

7. Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Файзуллин Д.А., Зуев Ю.Ф., Артюхов В.Г. Chitosan Graft Copolymers with N-Vinylimidazole as Promising Matrices for Immobilization of Bromelain, Ficin, and Papain Polymers, 14:2279 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/polym14112279

8. Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г., Лавлинская М.С., Артюхов В.Г. Acyl-Modified Water-Soluble Chitosan Derivatives as Carriers for Adsorption Immobilization of Papain Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol. 48, No. 2. – P. 310–320 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1134/S1068162022020212

9. Холявка М.Г., Гончарова С.С., Сорокин А.В., Лавлинская М.С., Редько Ю.А., Файзуллин Д.А., Байдамшина Д.Р., Зуев Ю.Ф., Кондратьев М.С., Каюмов А.Р., Артюхов В.Г. Novel Biocatalysts Based on Bromelain Immobilized on Functionalized Chitosans and Research on Their Structural Features Polymers, 14:5110 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/polym14235110

10. Холявка М.Г., Ковалева И.Ю., Бруева М.С., Богомолов Д.Ю., Панкова С.М., Королева В.А., Артюхов В.Г. In silico анализ особенностей пространственной организации молекул целлюлаз из различных продуцентов Актуальные вопросы биологической физики и химии, Т. 7, № 1. – С. 137-146 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.29039/rusjbpc.2022.0495

11. Холявка М.Г., Панкова С.М., Вышкворкина Ю.М., Лукин А.Н., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Chitosan as Photo Protector for Papain Immobilized on Its Matrix Biophysics (Russian Federation), Vol. 67, No. 3. – P. 365–373. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1134/S0006350922030095

12. Холявка М.Г., Панкова С.М., Вышкворкина Ю.М., Лукин А.Н., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Хитозан и сукцинат хитозана как фотопротекторы для иммобилизованного на их матрице папаина Радиационная биология. Радиоэкология, Т. 62, № 5. – С. 532–542 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.31857/S086980312205006X

13. А.В. Сорокин, С.С. Ольшанникова, М.С. Лавлинская, М.Г. Холявка, В.Г. Артюхов Стабилизация активности бромелина, папаина и фицина путем их комплексообразования с графт-сополимерами хитозана и N-винилимидазола Актуальная биотехнология, № 1. – С. 32 (год публикации - 2022)

14. Д.Р. Байдамшина, С.С. Гончарова, М.Г. Холявка, А.Р. Каюмов Оценка способности бромелина иммобилизованного на водорастворимых производных хитозана разрушать бактериальные биопленки V Всероссийская с международным участием школа-конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Материалы и технологии XXI века». Сборник тезисов, С. 12 (год публикации - 2022)

15. Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Гончарова С.С., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Повышение удельной протеолитической активности фицина путем его конъюгирования с карбоксиметилцеллюлозой и ее производными Книга тезисов школы-конференции для молодых ученых «Самоорганизация в «мягких» средах: достижения и современное состояние», С. 78 (год публикации - 2022)

16. Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Холявка М.Г., Юдин Н.Е., Артюхов В.Г. Стабилизация протеолитической активности папаина путем создания наноразмерных гибридных препаратов Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2022: материалы XVII международной научной конференции, С. 143 (год публикации - 2022)

17. М.Г. Холявка, С.М. Панкова, С.С. Ольшанникова, В.А. Королева, В.Г. Артюхов Влияние УФ-излучения в присутствии метиленового синего на процессы фотомодуляции ферментативной активности папаина, фицина, бромелина, свободных и иммобилизованных на матрице хитозана Актуальная биотехнология, № 1. – С. 256 (год публикации - 2022)

18. М.С. Лавлинская, А.В. Сорокин, С.С. Ольшанникова, М.Г. Холявка, В.Г. Артюхов Новые протеолитические ферментные препараты на основе бромелина, фицина и папаина и 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламид) хитозана Актуальная биотехнология, № 1. – С. 240 (год публикации - 2022)

19. Ольшанникова С., Холявка М., Королева В., Панкова С., Дубовицкая А., Беляева Т., Редько Ю., Малыхина Н., Богомолов Д., Пайметьева Д., Артюхов В. Kinetics of ficin molecules aggregation by dynamic light scattering European Journal of Clinical Investigation, V. 52. Supplement 1. – P. 90. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1111/eci.13796

20. Ольшанникова С., Холявка М., Королева В., Панкова С., Дубовицкая А., Беляева Т., Редько Ю., Малыхина Н., Богомолов Д., Пайметьева Д., Артюхов В. Kinetics of papain molecules aggregation by dynamic light scattering European Journal of Clinical Investigation, V. 52. Supplement 1. – P. 91 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1111/eci.13796

21. Ольшанникова С., Холявка М., Королева В., Панкова С., Дубовицкая А., Беляева Т., Редько Ю., Малыхина Н., Богомолов Д., Пайметьева Д., Артюхов В. Kinetics of bromelain molecules aggregation by dynamic light scattering European Journal of Clinical Investigation, V. 52. Supplement 1. – P. 91-92. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1111/eci.13796

22. Сорокин А.В., Гончарова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Образование комплекса бромелина, папаина и фицина и графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы и N-винилимидазола повышает активность цистеиновых протеаз Книга тезисов школы-конференции для молодых ученых «Самоорганизация в «мягких» средах: достижения и современное состояние», С. 58 (год публикации - 2022)

23. Сорокин А.В., Ольшанникова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Юдин Н.Е., Артюхов В.Г. Стабилизация активности бромелина, папаина и фицина путем их комплексообразования с графт-сополимерами натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и N-винилимидазола Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2022: материалы XVII международной научной конференции, С. 172-173 (год публикации - 2022)

24. Холявка М.Г., Панкова С.М., Артюхов В.Г. Гели хитозана и сукцината хитозана как фотопротекторы для трипсина Книга тезисов школы-конференции для молодых ученых «Самоорганизация в «мягких» средах: достижения и современное состояние», С. 77 (год публикации - 2022)

25. Холявка М.Г., Панкова С.М., Ольшанникова С.С., Королева В.А., Артюхов В.Г. Влияние УФ-излучения на удельную активность свободных и иммобилизованных путем адсорбции и включения в гели протеолитических ферментов Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2022: материалы XVII международной научной конференции, С. 183 (год публикации - 2022)

26. Холявка М.Г., Артюхов В.Г., Ольшанникова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В. Способ получения гибридного препарата папаина и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора -, Заявка № 2022121043 (год публикации - )

27. Холявка М.Г., Артюхов В.Г., Ольшанникова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В. Способ получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора -, Заявка № 2022121042 (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проведено полноатомное моделирование молекулярной динамики комплексов папаина (PDB-ID: 9PAP), бромелина (PDB-ID: 1w0q), фицина (PDB-ID: 4YYU) и матриц для их иммобилизации: хитозана, его производных – карбоксиметилхитозана, ацетата хитозана, хлорид гидроксипропилтриметил аммоний хитозана, N-малеоилхитозана, N-сукциноилхитозана, 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламид)хитозана, сульфата хитозана) и графт-сополимеров с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилата (ДМАЭМА). Установлено, что из представленного набора лигандов наиболее стабильный комплекс с папаином образовали хитозан и его ацетат, тогда как другие модификации носителя и графт-сополимеры продемонстрировали снижение сродства лиганда к глобуле папаина. Во всех случаях связывание происходило с частичным перекрыванием лигандом активного центра фермента. Можно утверждать, что графт-сополимеры оказывают стабилизирующий эффект на подвижность белковой глобулы, а также их ассоциаты не распадаются при растворении и изучении их динамического поведения. Показано, что в отличие от молекул других тиоловых протеаз, глобула бромелина имеет на поверхности значительное углубление – и здесь связываются исследуемые лиганды. В зависимости от размера лиганда, он при расчете либо в значительной степени оказывался в данной полости, либо «цеплялся» за её вход боковыми группами. Наиболее погруженные и неразветвлённые лиганды характеризуются самыми большими величинами энергии сродства – это ацетат и сульфат хитозана. Установлено, что подавляющее большинство молекул-носителей связывается строго в активном центре фицина, который расположен в протяжённом «кармане». Как и в случае папаина, выяснилось, что чем больше и разветвлённее молекула лиганда, тем выше вероятность, что её боковые группы будут выходить за границы этого «кармана» и связываться с аминокислотными остатками на поверхности боковой части глобулы. Это в полной мере проявилось в случае графт-сополимеров. Из представленного набора лигандов наиболее стабильный комплекс с глобулой фицина образовали производные хитозана: ацетат хитозана, сульфат хитозана, а также графт-сополимер хитозана с винилимидазолом. Изучены температурная и рН-зависимости, а также зависимость каталитической активности от концентрации субстрата для сочетаний фермент-носитель, которые проявляли протеолитическую активность после образования комплекса. Определены оптимумы температуры и рН среды для функционирования данных комплексов, рассчитаны значения Km, Vmax и kcat. В ходе выполнения проекта нам удалось оптимизировать методику иммобилизации цистеиновых протеаз таким образом, что протеолитическая активность фермента с носителем в комплексе в некоторых случаях получилась выше, чем активность свободного фермента. Это явление в англоязычной литературе называется «гиперактиваций». Увеличение активности наблюдалось для комплексов бромелина с N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозаном 600, 350 и 200 кДа, КМЦ- ДМАЭМА, папаина с 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламидо)хитозаном 350 кДа и фицина с N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозаном 350 и 200 кДа и КМЦ-ВИ. У этих же комплексов расчетные значения Vmax и kcat были выше, чем у остальных изучаемых нами образцов. Температурный оптимум ферментов не изменялся или немного расширялся в сторону увеличения значений температуры для комплексов протеаз с ацетатом и сульфатом хитозана (которые, кстати, образовывали наибольшее количество связей и взаимодействий с глобулами цистеиновых протеаз по сравнению с другими матрицами для иммобилизации). Оптимум рН сдвигался в более щелочную область у комплексов ферментов с N-малеоилхитозаном, сукцинатом хитозана, сульфатом хитозана и в меньшей степени ацетатом хитозана. Вероятно, эти полимеры образовывали вокруг молекул фермента микроокружение с более кислым значением рН, чем рН общего объема растворителя. Карбоксиметилхитозан, напротив, подщелачивал среду и комплексы ферментов с ним имели оптимум рН в диапазоне 6,5-7,5. Установлено, что наиболее устойчивыми к воздействию температур в диапазоне 60-80 ⁰С оказались комплексы, бромелина, папаина и фицина с 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламид)хитозаном, ацетатом и сульфатом хитозана, а также с графт-сополимером ХТЗ-ВИ. К действию щелочных значений рН среды (8,5, 9,0) устойчивыми оказались те же комплексы и комплексы протеаз с карбоксиметилхитозаном. В кислых средах (рН 5,5, 6,0) в большей степени активность сохраняли комплексы бромелина, папаина и фицина с ацетатом хитозана, сульфатом хитозана, сукцинатом хитозана, N-малеоилхитозаном и сополимером ХТЗ-ВИ. Проведены тестовые исследования и адаптация метода FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) к работе с ферментными системами и комплексами фермент-носитель. Изучены процессы ассоциации и агрегации методами FRAP на основе конфокальной микроскопии, ЯМР и ИК-спектроскопии. Установлено, что диффузионные спады во всех экспериментах с бромелином, папаином и фицином не описываются одной экспонентой. Показано, что во всех случаях КСД, получаемые при обработке данных разных методов близки. При этом значительного изменения наблюдаемого КСД не наблюдается во всем исследованном диапазоне концентраций. Проанализирована прочность комплексов цистеиновых протеаз с изучаемыми нами носителями после их инкубации в течение 30 и 60 мин при температурах 60, 70 и 80 ⁰С и рН среды 5,5, 6,0, 8,5, 9,0. Методом ИК-Фурье-спектроскопии проведены спектральные исследования иммобилизованных ферментных препаратов. О наличии белка на матрице носителя (т.е. о целостности и сохранности комплексов) судили по наличию и интенсивности следующих полос поглощения, типичных для белков: амид I (1630-1690 см-1) и амид II (1520-1560 см-1). Проведен сравнительный анализ степени инактивации и интенсивности агрегации протеаз в свободном и иммобилизованном состоянии. На основании этих данных, а также анализа времени полужизни свободных и иммобилизованных ферментов в условиях повышенной температуры и различного микроокружения был сделан вывод о том, что по совокупности критериев наиболее перспективными матрицами для иммобилизации с точки зрения сохранения активности и стабилизации фермента является графт-сополимеры с полисахаридной основной цепью из карбоксиметилцеллюлозы или хитозана с боковыми цепями из гомополимеров N-винилимидазола или N,N-диметиламиноэтилметакрилата, карбоксиметилхитозан, 2-(4-ацетамидо-2-сульфаниламид)хитозан. С целью идентификации наиболее активных деструкторов бактериальных биопленок среди предлагаемых нами носителей для иммобилизации цистеиновых протеаз (фицина, папаина, бромелина) осуществлен скрининг для выявления тех полимеров, которые не дают ложно отрицательного результата. Для оценки способности разрушать бактериальные биопленки в качестве модельных объектов исследований протестированы лабораторные штаммы и клинические изоляты грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, обладающих медицинской значимостью (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcessens и другие). На основании полученных данных для дальнейших исследований с целью разрушения бактериальной биопленки, полученной из зубного налёта, был выбран комплекс фермента фицина с карбоксиметилхитозаном 200 кДа (далее КМХ). Выявлено, что фицин иммобилизованный на КМХ, значительно разрушает биопленки C. albicans, в то время как для бактериальных биопленок S. mutans и S. aureus наблюдается значительное снижение плотности клеток. Кроме того, нам удалось добиться повышения эффективности хлоргексидина путем комбинирования с иммобилизованным на карбоксиметилхитозане фицином.

Публикации

1. Байдамшина Д.Р., Тризна Е.Ю., Гончарова С.С., Сорокин А.В., Лавлинская М.С., Мельник А.П., Гафарова Л.Ф., Харитонова М.А., Остолоповская О.В., Артюхов В.Г., Соколова Е.А., Холявка М.Г., Богачев М.И., Каюмов А.Р., Зеленихин П.В. The Effect of Ficin Immobilized on Carboxymethyl Chitosan on Biofilms of Oral Pathogens International Journal of Molecular Sciences, Vol. 24. Article Number 16090 (год публикации - 2023)

2. Гончарова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Биокатализаторы на основе ассоциатов папаина с наночастицами хитозана Конденсированные среды и межфазные границы, Т. 25, №2. С. 173-181. (год публикации - 2023)

3. Малыхина Н.В., Ольшанникова С.С., Холявка М.Г., Сорокин А.В., Лавлинская М.С., Артюхов В.Г., Файзуллин Д.А., Зуев Ю.Ф. Получение комплексов фицина с карбоксиметилхитозаном и N-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозаном и изучение их структурных особенностей Биоорганическая химия, Т. 49, № 1. С. 93-104 (год публикации - 2023)

4. Сорокин А.В., Гончарова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Зуев Ю.Ф., Файзуллин Д.А., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Исследование механизма взаимодействия фицина с графт-сополимером натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы и N-винилимидазола методами молекулярного докинга, инфракрасной спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния Биофизика, Т. 68, № 2. С. 248-256 (год публикации - 2023)

5. Сорокин А.В., Гончарова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Файзуллин Д.А., Зуев Ю.Ф., Кондратьев М.С., Артюхов В.Г. Complexation of Bromelain, Ficin, and Papain with the Graft Copolymer of Carboxymethyl Cellulose Sodium Salt and N-Vinylimidazole Enhances Enzyme Proteolytic Activity International Journal of Molecular Sciences, Vol. 24, No 14, Article Number 11246 (год публикации - 2023)

6. Сорокин А.В., Гончарова С.С., Лавлинская М.С., Холявка М.Г., Файзуллин Д.А., Кондратьев М.С., Канныкин С.В., Зуев Ю.Ф., Артюхов В.Г. Carboxymethyl Cellulose-Based Polymers as Promising Matrices for Ficin Immobilization Polymers, Vol.15, Article Number 649 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/polym15030649

7. Холявка М.Г., Гончарова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Артюхов В.Г. Novel biocatalysts based on enzymes in complexes with nano and micromaterials Biophysical Reviews, V. 15. P. 1127–1158 (год публикации - 2023)

8. Холявка М.Г., Артюхов В.Г., Гончарова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО ПРЕПАРАТА БРОМЕЛАЙНА И АСКОРБАТА ХИТОЗАНА В ВИДЕ ГУСТОГО РАСТВОРА -, 2023128680 (год публикации - )

9. Холявка М.Г., Артюхов В.Г., Гончарова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО ПРЕПАРАТА ПАПАИНА И АСКОРБАТА ХИТОЗАНА В ВИДЕ ГУСТОГО РАСТВОРА -, 2023128677 (год публикации - )

10. Холявка М.Г., Артюхов В.Г., Гончарова С.С., Редько Ю.А., Лавлинская М.С., Сорокин А.В. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО ПРЕПАРАТА ФИЦИНА И АСКОРБАТА ХИТОЗАНА В ВИДЕ ГУСТОГО РАСТВОРА -, 2023128673 (год публикации - )

11. - В Воронеже создали мощное антибактериальное средство на основе инжира и хитина Тасс Наука, - (год публикации - )