Фундаментальные закономерности взаимодействия молекулярных распознающих элементов на основе олигонуклеотидов с мишенями различной природы.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-73-20240

НазваниеФундаментальные закономерности взаимодействия молекулярных распознающих элементов на основе олигонуклеотидов с мишенями различной природы.

Руководитель Кичкайло Анна Сергеевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук" , Красноярский край

Конкурс №51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах; 03-505 - Строение молекул и молекулярная спектроскопия

Ключевые слова молекулярные распознающие элементы, лиганд, мишень, межмолекулярные взаимодействия, энергия связи, олигонуклеотид, аптамер, синхротронное излучение, малоугловое рентгеновское рассеяние, пространственная структура, симметрия, биосенсор, спектроскопия, гигантское комбинационное рассеяние

Код ГРНТИ34.17.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Чувствительность диагностических систем и эффективность адресной терапии определяется энергией взаимодействия между распознающими и/или воздействующими элементами (лигандами) и мишенями. До настоящего времени не разработан универсальный алгоритм изучения механизмов распознавания в биологических системах лигандов со своими мишенями по причине большого разнообразия видов их взаимодействий: конформационных, индуцированных, электростатических, дисперсионных, водородных связей и т.д. Определение механизмов и видов взаимодействия между молекулярными распознающими элементами на основе олигонуклеотидов с мишенями различной природы является важной фундаментальной задачей, решение которой позволит увеличить точность диагностики и эффективность адресной терапии. Основной задачей в решении проблемы является использование комплексного подхода для изучения особенностей молекулярных взаимодействий, сайтов связывания, кинетики, энергии и типа связей мишеней различной природы с молекулярными распознающими элементами на основе олигонуклеотидов. Традиционно в качестве распознающих элементов в диагностике и терапии используются высокоспецифичные антитела. В настоящее время все большее распространение получают ДНК- и РНК-олигонуклеотиды, обладающие большим комбинаторным разнообразием, позволяющим им связываться с молекулярными мишенями различной природы: от ионов и маленьких молекул до белков и клеток. Поскольку в основе разработки любых адресных лекарственных препаратов и биосенсоров лежат фундаментальные знания об объектах (лигандах, мишенях, механизмах и особенностях их взаимодействия, а также вызываемых эффектах), то решение этой задачи должно быть междисциплинарным, а его выполнение должно способно внести существенный вклад в реализацию нескольких приоритетов, определенных Стратегией научно-технологического развития РФ. Проект направлен на установление фундаментальных закономерностей взаимодействия молекулярных распознающих элементов на основе олигонуклеотидов с мишенями различной природы для создания чувствительных сенсоров для количественного определения аналитов и эффективных средств адресной терапии. Основные задачи связаны с: (1) экспериментальным определением методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) и EXAFS-спектроскопии в синхротронном центре КИСИ-Курчатов пространственных конформаций молекулярных распознающих элементов на основе олигонуклеотидов в буферных растворах с ионами легких или тяжелых металлов и без них; (2) экспериментальным определением пространственных конформаций мишеней молекулярных распознающих элементов методом МУРР; (3) экспериментальным определением пространственных конформаций комплексов молекулярных распознающих элементов с мишенями методом МУРР; (4) расчетом структурных параметров исследуемых молекул и комплексов, восстановлением пространственных структур и электронной плотности молекул; (5) экспериментальным определением сайтов связывания мишеней с олигонуклеотидами методами масс-спектрометрии (МС), (МУРР), гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и EXAFS-спектроскопии синхротронного центра КИСИ-Курчатов; (6) вычислительным моделированием и исследованием молекулярной динамики комплексов взаимодействующих олигонуклеотидов с мишенями, расчетом энергий взаимодействия, типов межмолекулярных связей; (7) экспериментальным определением констант связывания мишеней с олигонуклеотидами методами поверхностного плазмонного резонанса, эллипсометрии и поляризации флуоресценции; (9) экспериментальным определением силы связывания олигонуклеотидов с мишенями методом атомно-силовой микроскопии; (10) выяснением фундаментальных закономерностей взаимодействия целевых белков и молекулярных структур, полученных с помощью вычислительных методов, и доработкой метода вычислительного моделирования с учетом этих закономерностей. В процессе выполнения проекта впервые будет разработан новый комплексный подход к изучению молекулярных механизмов взаимодействия распознающих элементов (ДНК-лигандов) с мишенями различной природы (белки, полисахариды, малые молекулы, ионы) в жидкостях в зависимости от температуры, ионного состава и pH среды. С использованием синхротронного излучения методами МУРР, EXSFS, EXAFS будут восстановлены пространственные структуры и симметрия ближайшего окружения во взаимодействующих молекулах поодиночке и в комплексах. Впервые будет изучена возможность замены в буферных системах ионов легких металлов тяжелыми, а в случае сохранения свойств молекулярных распознающих элементов, тяжелые металлы будут использованы для изучения пространственной симметрии молекул на атомарном уровне. С помощью методов ГКР и МУРР будет получена информация о сайтах связывания. Константы коллективного взаимодействия между молекулами (диссоциации, ассоциации и др.) будут изучены с помощью методов поверхностного плазмонного резонанса, эллипсометрии и поляризации флуоресценции. Сила связей между отдельными молекулами будет изучена с помощью атомно-силовой микроскопии. Все экспериментальные данные будут использованы для молекулярного моделирования поведения взаимодействующих молекул. Биологический эффект взаимодействия для каждой пары лиганд/мишень будет подтверждаться экспериментально. Будут получены новые знания о строении и пространственной структуре нескольких молекулярных распознающих элементов и их молекулах-мишенях. Эти данные лягут в основу разработки биосенсоров и терапевтических препаратов, возможность создания которых будет обоснована экспериментально в рамках проекта. Впервые в мире особенности взаимодействия лигандов (олигомеров нуклеиновых кислот) с мишенями различной природы в физиологических условиях будут изучены комплексом экспериментальных и вычислительных методов. Пространственные структуры отдельных молекул и их комплексов, точные сайты связывания и энергии взаимодействий будут определены в жидкости при различных температурах, ионном составе и рН среды методом малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) и EXAFS-спектроскопии. Молекулярное моделирование будет проводиться с помощью пакетов программ для молекулярного конструирования, докинга, молекулярной динамики, FMO и PIEDA. Результаты проекта будут использованы при разработке адресных лекарственных средств, воздействующих только на определенные мишени, установление механизмов действия препаратов, определения их специфичности. Полученные в результате проекта знания о количественных характеристиках связывания и механизмах, обеспечивающих взаимодействие на молекулярном уровне необходимы для разработки точных тест-систем с возможностью количественного определения очень низких концентраций аналитов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Морозов Д., Миронов В., Морячков Р.В., Щугорева И.А., Артюшенко П.В., Замай Г.С., Коловская О.С., Молоденский Д.С., Заблуда В.Н., Вепринцев Д.В., Соколов А.Э., Зуков Р.А., Березовский М.В., Томилин Ф.Н., Федоров Д.Г., Алексеев Ю., Кичкайло А.С. The Role of Small-Angle X-Ray Scattering and Molecular Simulations in 3D Structure Elucidation of a DNA Aptamer Against Lung Cancer Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2021, 25, 316-327 (год публикации - 2021)
10.1016/j.omtn.2021.07.015

2. Николаева П.А., Морячков Р.В., Ралдугина В.Н., Наумова Ю.О., Новикова Т.М., Спиридонова В.А. Structural analysis of thrombin-binding G-aptamers in presence of bivalent ions Сибирское медицинское обозрение, 5 (137):111-113. DOI 10.20333/25000136-2022-5-111-113 (год публикации - 2022)
10.20333/25000136-2022-5-111-113

3. Миронов В., Щугорева И.А., Артюшенко П.В., Морозов Д., Морячков Р.В., Коловская О.С., Вепринцев Д.В., Францискис В., Гроенхоф Г., Янг С., Московский А.А., Федоров Д.Г., Томилин Ф.Н., Тан В., Алексеев Ю., Березовский М.В., Кичкайло А.С Structure and interaction Based Design of Anti-SARS-CoV-2 Aptamers Chemistry A European Journal, 12 (28), 1-16. https://doi.org/10.1002/chem.202104481 (год публикации - 2022)
10.1002/chem.202104481

4. Пулсуп С., Зарипов Э. , Хюттманн Н. ,Минич З. , АртюшенкоП. В., Щугорева И. А., Томилин Ф. Н., Кичкайло А. С., Березовский М. В. Discovery of DNA aptamers targeting SARS-CoV-2 nucleocapsid protein and protein-binding epitopes for label-free COVID-19 diagnostics Molecular Therapy: Nucleic Acid, Т. 31. – С. 731-743 (год публикации - 2023)
10.1016/j.omtn.2023.02.010

5. Замай Т.Н., Коловская О.С., Замай Г.С., Кириченко А.К., Лузан Н.А., Неверова Н.А., Медведева Е.Н., Бабкин В.А., Вепринцев Д.В., Щугорева И.В., Кичкайло А.С. Unleashing the antitumor power of cyclophosphamide by arabinogalactan and aptamer conjugation EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICS AND BIOPHARMACEUTICS , 204: 114531 (год публикации - 2024)
10.1016/j.ejpb.2024.114531

6. Артюшенко П. В. , Щугорева И. А., Берлина А. Н., Комова Н. С. , Серебренникова К. В. , Морячков Р. В. , Заблуда В. Н. , Соколов А. Э. , Томилин Ф. Н. , Кичкайло А. С. Structure Determination of the Pb2+-specific GT Aptamer Using SAXS and Molecular Modeling Methods Journal of Siberian Federal University. Mathematics & Physics, Journal of Siberian Federal University. Mathematics & Physics 2024, 17(6), 808–816 (год публикации - 2024)
10.17516/1997-1397

7. Артюшенко П.В., Щугорева И.А., Коловская О.С., Рогова А.В., Морячков Р.В., Заблуда В.Н., Замай Т.Н., Крат А.В., Зуков Р.А., Томилин Ф.Н., Кичкайло А.С. Рациональная оптимизация аптамера, специфичного к поверхности раковых клеток легкого, с помощью математического моделирования и малоуглового рентгеновского рассеяния Российские нанотехнологии=Nanobiotechnology Reports, № 3, т. 19, стр. 295-300 (год публикации - 2024)
10.56304/S1992722323601106

8. Кошманова А. А., Артюшенко П. В., Щугорева И. А., Федотовская В. Д., Лузан Н. А., Коловская О. С., Замай Г. С., Лукьяненко К. А., Вепринцев Д. В., Хилажева Е. Д., Замай Т. Н., Иванова Д. А., Кастюк М. Р., Лапин И. Н., Светличный В. А., Томилин Ф. Н., Швед Н. А., Гулая В. С., Кумейко В. В., Березовский М. В., Кичкайло А. С. Aptamer’s Structure Optimization for Better Diagnosis and Treatment of Glial Tumors Cancers, 16(23), 4111 (год публикации - 2024)
10.3390/cancers16234111

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Отчетный 2024 год был направлен на обобщение и анализ результатов, полученных за весь срок реализации проекта. Было разработано устройство вакуумного объема с держателем жидкого образца для станции БиоМУР. Предложено два варианта ячейки. Первый позволяет помещать сразу два разных образца с возможностью перемещать ячейку-держатель относительно рентгеновского пучка для двух последовательных измерений без участия оператора для смены образцов. Вторым вариантом является схема с двумя плоскопараллельными пластинами с круглыми отверстиями для расположения капли с раствором образца между данными отверстиями. В схеме реализована возможность регулировать толщину слоя образца путём изменения расстояния между пластинами и настраивать необходимое количество исследуемого вещества, не меняя концентрации вещества в образце, а меняя только толщину экспонируемого объёма. Второй вариант ячейки-держателя предложен в качестве основного. Для обработки результатов МУРР для комплексов аптамер/белок был опробован подход моделирования “твёрдыми телами” (“rigid-body modeling”) в программе SASREF из программного пакета ATSAS. Процедура моделирования проводилась с использованием структуры белка RBD и аптамера D-Apt, для которого рассматривали две возможные конформации. Наилучшее значение невязки для комплекса D-Apt/RBD с первым вариантом структуры D-Apt составило χ2 = 2.66, со вторым вариантом невязка вышла в значении χ2 = 2.19. Метод даёт возможность с небольшими трудозатратами и оперативно найти пространственные структуры молекул и комплексы, которые можно использовать как стартовые шаги для последующих этапов построения моделей. С помощью атомно-силового микроскопа Bruker BioScope Resolve определены силы связывания аптамера D-Apt с белком RBD. При вычислениях применялась модель простого гармонического осциллятора. Адгезия функционализированного D-Apt кантилевера составило 330,0 пН (sd=89,83), т.е. в 2 раза больше, чем у контрольного, что указывает на высокую аффинность аптамера D-Apt к белку RBD. Сила связывания моноклонального антитела с рецептор-связывающим доменом (RBD) S-белка SARS-CoV-2, взятая из литературы, была в 5 раз выше (1665.2±121.3 пН), однако в других исследованиях силы связывания антител с S-белком SARS-CoV-2 имели более низкие значения – от 40 до 105 пН. Таким образом, сравнение сил связывания между аптамером D-Apt и белком RBD и моноклональных антител с этой же мишенью продемонстрировало сопоставимый уровень аффинности. Наиболее эффективные методы молекулярного моделирования для восстановления атомной структуры аптамеров и комплексов аптамер/мишень, а также для модификации аптамеров, представлены в виде алгоритмов, которые были отработаны и скорректированы на примере аптамера LC224 к раку лёгкого, аптамера Gli-55 к глиобластоме и аптамера tSp10 к S-белку SARS-CoV-2. Для AptS1-tSP10 была смоделирована 3D структура аптамера, белка и их комплекса. Установлено, что большинство контактов между аптамером и белком обусловлены электростатическим взаимодействием. Пары, в которых преобладает дисперсионное взаимодействие, образованы аминокислотами, входящими в сайт связывания SA10. Алгоритм модификации аптамеров отработан на примере модификации аптамеров LC224 и Gli-55. Предложенные укороченные аптамеры Gli-35 и LC-224t синтезированы и их свойства исследованы in vitro. Сопоставление полученной 3D модели аптамера LC-224t с данными МУРР подтвердили, что модель соответствует структуре аптамера в растворе. Теоретические данные о взаимодействии аптамер-мишень должны дополняться экспериментальными исследованиями с использованием биологических объектов такими методами как проточная цитометрия, электрохимические методы, микроскопия, в том числе АСМ, с подтверждением биологической эффективности и др. Высокая аффинность аптамера tNSP3 к нуклеопротеину SARS-CoV-2 была верифицирована с помощью оптического аптасенсора, что позволило обнаружить N-белок в слюне с пределом его обнаружения 4,5 нМ. Аффинность разработанного in silico аптамера Apt31 к рецептор-связывающему домену RBD была подтверждена с помощью электрохимического аптасенсора, позволившего определить SARS-CoV-2 в клинических образцах слюны больных-носителей коронавирусной инфекции. Аффинность аптамера LC-224 к РЛ была подтверждена методом проточной цитометрии на послеоперационных тканях рака легкого. С помощью молекулярного моделирования разработана формула, использующая механокомпозит арабиногалактана с циклофосфамидом и ДНК-аптамер As42. Установлено, что ДНК-аптамер As42 взаимодействует с моносахаридами арабиногалактана с помощью водородных связей. Полученная формула демонстрирует потенциал в смягчении побочных эффектов химиотерапии и усилении ее противораковых свойств. Представленные алгоритмы применения экспериментальных и теоретических методов были использованы для моделирования аптамера к рецептор связывающему домену RBD S-белка SARS-CoV2. Аптамер V-формы, названный D-Apt, был смоделирован на основе аптамера Apt31. Молекулярное моделирование показало, что D-Apt взаимодействует с мишенью желаемым образом, закрывая верхнюю часть белка. Аптамер D-Apt был синтезирован и его взаимодействие с RBD было детально изучено in vitro. Синхротронные данные МУРР для ДНК-аптамера D-Apt были собраны на станции TPS 13A BioSAXS синхротрона Taiwan Photon Source, NSRRC, Синьчжу, Тайвань. Сопоставление теоретической модели аптамера с результатами эксперимента МУРР показало расхождение χ2 = 2.17. Для изучения пространственной структуры комплекса D-Apt/RBD был использован режим совмещённого использования жидкостной гель-хроматографии и МУРР (Size-Exclusion Chromatography и SAXS, SEC-SAXS). Данные МУРР для молекулярного комплекса D-Apt/RBD были получены на станции P12 BioSAXS Европейской лаборатории молекулярной биологии, на накопительном кольце PETRA III синхротрона DESY. Значение невязки для молекулярной модели χ2 = 5.015 продемонстрировало неполное совпадение структур. При этом соответствие объёма структуры ожидаемой молекулярной массе и шариковой формы МУРР полученной молекулярной модели, говорит о корректном предположении пространственного расположения аптамера и белка в комплексе. Для исследования связи между ДНК-аптамером D-Apt и RBD был применен метод АСМ. Результаты исследований АСМ продемонстрировали высокую эффективность связывания аптамера D-Apt с S-белком коронавируса SARS-CoV-2. По результатам работы был проведён анализ экспериментальных и теоретических методов исследования структуры аптамеров с мишенями различной природы, выявлены плюсы и минусы их использования, накладываемые ограничения методов и требования к образцам и условиям проведения измерений и расчетов.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Алгоритмы, разработанные в рамках данного проекта, опубликованы и уже используются для оптимизации структур аптамеров с целью улучшения их свойств при разработке лекарственных и диагностических средств. В продолжении данного проекта подана новая заявка РНФ с ОИ НИЦ Курчатовский с участием основных исполнителей данного проекта, в рамках которого будут использованы результаты данного проекта для разработки инновационных средств терапии глиальных опухолей на основе аптамеров. В рамках нового гранта планируется создание новой фармацевтической субстанции для адресной терапии опухолей головного мозга. Субстанция будет готова для дальнейшей доработки совместно с фармацевтическими компаниями — индустриальными партнёрами, с целью разработки готовой лекарственной формы.