Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Методами малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) изучены пространственные структуры ДНК-аптамеров, аффинных и специфичных белкам-биомаркерам рака легких человека и рецептор-связывающему домену SARS-CoV-2 коронавируса. Обработку данных МУРР осуществляли в программном пакете ATSAS. Анализ графиков МУРР, вычитание сигнала от буфера, анализ Гинье и Кратки (определение компактности пространственной укладки молекулы) проводили в программе PRIMUS, расчёт объёма, занимаемого молекулой – в программе DATPOROD, молекулярной массы – в программе DATMW, построение функции распределения по расстояниям p(r) – в программе GNOM, построение шариковых моделей пространственной формы – в программах DAMMIN и DAMMIF, оценку уникальности формы относительно функции p(r) – в программе AMBIMETER, сравнение PDB-структур молекулярных моделей с графиком МУРР – в программе CRYSOL, а также через плагин SASpy в программе PyMOL. Определены максимальный размер частиц Dmax, радиус инерции Rg, объём частиц, молекулярная масса, построены парные функции распределения по расстояниям, а также расчёты пространственной формы аптамера LC18t в виде шариковой структуры формата PDB из псевдоатомов. Для сопоставления молекулярных структур высокого разрешения, полученных в результате проведения процедур молекулярной динамики и фрагментации молекулярных орбиталей (FMO), были использованы три программы – CRYSOL, WAXSiS и PEPSY-SAXS. В результате экспериментальной работы и теоретических расчетов показано, что в буферном растворе (рН 7,4) ДНК-аптамер LC18t находится в состоянии мономера. Его рассчитанная молекулярная масса составляет примерно 10.8 кДа, что соответствует ожидаемой молекулярной массе молекулы – около 10.75 кДа. Рассчитанные структурные параметры аптамера LC18t в буфере: максимальный размер Dmax = 6.7 нм, радиус инерции Rg = 2.06 ± 0.04 нм, объём молекулы V = 15.26 нм3. На основании полученных экспериментальных и расчётных данных построена шариковая модель из псевдоатомов пространственного распределения электронной плотности аптамера LC18t. Проведенные теоретические расчёты и данные МУРР свидетельствуют о наличии в буфере нескольких близких конформаций аптамера, либо о подвижности и неполной стабильности конформации аптамера в растворе. Структурные параметры аптамера к рецептор-связывающему домену SARS-CoV-2 коронавируса согласно расчетным данным сставили: максимальный размер молекулы Apt31 Dmax = 6.5 ± 0.2 нм, радиус инерции Rg = 1.9 ± 0.03 нм, объём частицы V = 12.3 нм3. Показано, что эти параметры соответствуют массе молекулы MWSAXS = 10.8 кДа, что близко к ожидаемой молекулярной массе молекулы – 9.52 кДа. На основании данных МУРР построена шариковая модель аптамера. Выявлено, что молекулярная модель аптамера Apt31, ввиду наличия стабильной структуры, благодаря жёстко скрепляющей комплементарной части, имеет всего одну конформацию, которая даёт очень хорошее совпадение с экспериментом, невязка между теоретическим графиком МУРР и экспериментальным составила χ2 = 1.152. Это свидетельствует о хорошей достоверности предложенной модели, хотя при этом шариковая модель пространственного распределения электронной плотности не полностью совпала с моделью, полученной с применением молекулярной динамики. С помощью методов масс-спектрометрии определены целевые мишени аптамеров, специфичных к клеткам рака легких человека. Мишени биотинилированных укороченных версий аптамеров LC-2108t и LC-18t определяли двумя альтернативными способами – традиционным, с помощью стрептавидиновых магнитных частиц, и альтернативным, с помощью стрептавидинового агарозного геля и фильтр-колонок. Для выявления наиболее вероятных белков-кандидатов в мишени аптамеров к раку легкого человека было использовано два альтернативных способа анализа: с помощью коэффициентов корреляции между рабочими пробами и контролем и статистической программы оценки достоверного преобладания белков в рабочих пробах по сравнению с контрольными. Программа написана на языке R в Университете Оттавы (Канада). Проверку гомологии между белками-кандидатами в мишени аптамеров производили с помощью сервиса BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Функциональную и структурную классификацию белков проводили с помощью сервиса Panther (http://pantherdb.org/). Поиск пост-трансляционных модификаций в белках-кандидатах в мишени аптамеров осуществляли с помощью программы Proteome Discoverer 1.4. Показано, что наиболее вероятной мишенью аптамера LC-2108t является белок фибронектин (Fibronectin P02751). Пост-трансляционных модификаций фибронектина, выделенного из аденокарциномы легкого человека, не выявлено. Наиболее вероятными мишенями аптамера LC-18t являются нейтрофил дефензин (Neutrophil defensin 3 P59666), актин (Actin P68032, P60709, P68133), виментин (Vimentin З08670) и аннексин (Annexin A5 P08758). Все белки-кандидаты будут в дальнейшем подтверждаться валидацией альтернативными методами, в том числе молекулярным докингом и экспериментами по связыванию с рекомбинантными белками. Проведены измерения распределения электронной плотности в пространстве относительно центра масс молекул. Получены тонкие структуры спектров осцилляций коэффициента поглощения в интервале энергии излучения от десятков эВ до 1-2 кэВ относительно порога возбуждения свинца методами EXAFS в обратном и прямом пространстве, а также методом XANES. Проанализирована зависимость конформационных изменений ДНК-аптамеров к раку легких и рецептор-связывающему домену SARS-CoV-2 от состава, температуры и pH раствора, содержания ионов различных металлов и их концентраций. Анализ конформационных изменений аптамеров к раку легкого и RBD белка SARS-CoV-2 проводили методом гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Показано, что для LC18t, LC224t и LC2108t аптамеров характерна полоса аденозина (1344 см-1), высокий вклад растяжения С-С связей (1572-1586 см-1), которая наиболее выражена у LC224t (имеет самое сильное растяжение С-С связей по сравнению с остальными образцами). Выяснено, что для аптамеров к раку легких характерна пространственная укладка молекулы, схожая с α-спиралью. Показано, что конформация аптамеров неизменна в диапазоне температур от +10°С до +40°С. Различные концентрации ионов кальция, магния и водорода практически не влияли на конформацию аптамеров и их аффинность и специфичность по отношению к молекулярным мишеням. С помощью ГКР показано, что для группы аптамеров к рецептор-связывающему домену SARS-CoV-2 характерны максимумы полос при 745, 922 см-1, характеризующие валентные колебания аденина, изгиб бензольного кольца соответственно, 1372 см-1 - CH3 симметричные колебания и 1637 см-1, что характерно для α-укладки. Для аптамера Apt27 также присутствуют полосы, характерные для укладки β-листа. Исследованы спектры ГКР комплексов ДНК-аптамеров с белком RBD. Показано, что в спектрах ГКР комплексов аптамеров к рецептор-связывающему домену SARS-CoV-2 с белком RBD присутствуют полосы от RBD и аптамеров. Выяснено, что белок RBD в воде и буфере по-разному взаимодействуют с аптамерами. Для комплексов с RBD в воде характерно значительное увеличение вклада в спектр высокочастотной области 2800-300 см-1. Для всех комплексов характерны асимметричные колебания =СН3 связи, которых не было. Полоса 2920 см-1, характеризующая валентные колебания СН связи отсутствует в спектрах комплексов с RBD в воде. У Apt31 в комплексе RBD1+Apt31 снижается вклад полосы 1362 см-1, характеризующей растяжение ароматического кольца. В спектрах комплексов присутствует полоса на 1570 см-1 от RBD1. Широкая полоса в области 920-940 см-1 указывает на изгиб моды бензольного кольца B в плоскости и N–Ca–C, Са-С растяжения, которые отсутствовали у аптамеров без комплекса. Полученные результаты гигантского комбинационного рассеяния будут использованы для определения конформации аптамеров и их взаимодействия с молекулярными мишенями. Исследована зависимость аффинности и специфичности ДНК-аптамеров, специфичных белкам-биомаркерам рака легких человека и рецептор-связывающему домену SARS-CoV-2 от состава, температуры и pH раствора, содержания ионов различных металлов и их концентраций. Для аптамеров определены константы диссоциации и ассоциации в различных условиях. Аффинность и специфичность аптамеров к белкам-биомаркерам рака легкого человека исследовалась методом проточной цитометрии с использованием первичных клеточных культур аденокарциномы легкого человека. Аффинность и специфичность аптамеров рецептор-связывающему домену SARS-CoV-2 оценивалась методом поляризации флуоресценции. Определены зависимости аффинности и специфичности аптамеров от температуры, рН, содержания катионов кальция и магния. Определены константы диссоциации и ассоциации аптамеров. Проведен молекулярный дизайн ДНК-аптамеров, специфичных белкам-биомаркерам рака легких человека и рецептор-связывающему домену SARS-CoV-2 на основе данных МУРР и EXAFS. Для предсказания вторичной структуры аптамера, были использованы онлайн серверы для фолдинга ДНК-молекул OligoAnalyzer и MFold. Моделирование проводилось с учётом условий эксперимента МУРР. Для температуры 5°С MFold предложил 7 возможных вторичных структур, OligoAnalyzer при этих же условиях выдал 17 вариантов сворачивания ДНК. При 20°С MFold и OligoAnalyzer показали 5 и 11 вариантов вторичной структуры LC-18t, соответственно. С учётом ранжирования конформаций по энергии из всех результатов были отобраны четыре модели (Мodel-1, Мodel-2, Мodel-3, Мodel-4), причем модель М1 по данным обеих программ выбрана, как наиболее вероятная вторичная структура LC-18t. Для выбранных вторичных структур были построены 3D модели с помощью молекулярного редактора Avogadro. Оптимизация геометрии была выполнена в программе GAMESS с применением метода функционала плотности DFTB3 и метода фрагментации молекулярных орбиталей (FMO). Для учёта растворителя была использована модель поляризуемого континуума (PCM). Распределение структур LC-18t в порядке увеличения их полной энергии после оптимизации выглядело следующим образом: Мodel-4→ Мodel-1→ Мodel-3→ Мodel-2, что отличается от распределения в MFold и OligoAnalyzer. Сравнение геометрии молекул с экспериментом МУРР показало наибольшее совпадение для модели Мodel-4. С помощью методов проточной цитометрии с использованием первичных клеточных культур аденокарицномы легкого человека показано, что значение константы диссоциации (KD) для укороченного аптамера LC-18t составило 19,4 нМ, что оказалось почти на порядок меньше, чем для неусечённого аптамера LC-18 (149,2 нМ). Это означает, что энергия связи для аптамера LC-18t намного выше, чем для LC-18. Следовательно, для замены аптамера LC-18t требуется высокая концентрация аптамера LC-18. Полученные результаты свидетельствует о том, что при укорочении аптамера его аффинность и специфичность увеличивается. Чтобы продемонстрировать, что усеченный аптамер непосредственно связывается с раковыми клетками в тканях пациента так же, как и его предшественник аптамер LC-18, проведена окраска тонких парафиновых срезов тканей аденокарциномы легких. Микроскопический анализ выявил совместную локализацию LC-18t с антителами против карциноэмбрионального антигена (CEA), которые используются для окрашивания опухолевых клеток легких. Антитела и аптамеры окрашивают одни и те же клетки с одинаковой интенсивностью флуоресценции, но с немного другой локализацией. Проточная цитометрия демонстрирует, что LC-18t связывается с опухолевыми клетками легких, полученными от пациента, но не связывается со здоровыми легкими. Олигонуклеотид (AG)40 , взятый в качестве неспецифического контроля, не связывался с клетками рака легких. Результаты исследований связывания аптамера с RBD (рецептор-связывающим доменом SARS-CoV-2), выполненных тремя различными методами: проточной цитометрией, поляризацией флуоресценции и малоугловым рассеянием рентгеновских лучей, показали высокую степень аффинности аптамера Apt31 к рецептор-связывающему домену SARS-CoV-2. Кроме того, показано, что аффинность аптамера к RBD не изменяется при изменении температуры в пределах от 10°С до 40°С и в условиях изменения концентрации ионов кальция и магния. Тонкие структуры спектров осцилляций коэффициента поглощения в интервале энергии излучения от десятков эВ до 1-2 кэВ относительно порога возбуждения свинца методами EXAFS в обратном и прямом пространстве, полученные на станции СТМ в НИЦ “Курчатовский институт”, продемонстрировали близкое сходство для растворов со свинцом и с добавлением аптамера GT. Это указывает на постоянство валентного состояния Pb. Доказательство изменения в структуре ближайшего окружения атомов свинца было получено из качественного анализа EXAFS-спектров. Анализ модулей Фурье-преобразования от EXAFS функций k3χ(k) выше L3-края поглощения Pb для растворов со свинцом и с добавлением аптамера GT указывает на наличие локального разупорядочения, а раздвоение – на появление не менее двух выделенных расстояний в структуре олигонуклеотидов.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Задачами данного этапа стали исследования пространственной структуры ряда аптамеров и их комплексов с мишенями, изучение поверхности активных сайтов молекул аптамеров и распределения зарядов. Помимо этого, стола задача определения энергий связывания и типов взаимодействий олигонуклеотидов с ионами тяжелых металлов. Изучение пространственных структур были выполнены методом МУРР на станции СТМ в НИЦ “Курчатовский институт” с последующей обработкой данных в программном пакете ATSAS. Установлено, что аптамер GT в отсутствие своих мишеней – ионов тяжелых металлов имеет максимальный размер в растворе Dmax = 9.0 нм и радиус инерции Rg = 1.99 нм, молекула имеет вытянутую форму и толщину 2 нм, молекулярную массу 7.3 кДа (в доверительном диапазоне 6.7-9.1 кДа), что соответствует структуре димера. Спектры КД демонстрируют положительные максимумы, характерные для параллельной топологии (около 260 нм). Смоделированные формы аптамера GT (линейная, квадруплекс-мономер и квадруплекс-димер), сопоставленные с результатами МУРР и спектром КД свидетельствуют о том, что аптамер GT в растворе находится в конформации квадруплекса-димера, однако это не позволяет считать модель, однозначно описывающей структуру GT в растворе, и считать квадруплекс-димер единственной конформацией аптамера GT в растворе. Для аптмера GT в сухом виде в присутствии ионов Hg и Pb были получены тонкие структуры спектров осцилляций коэффициента поглощения в интервале энергии излучения от десятков эВ до 1 кэВ относительно порога возбуждения ртути методами EXAFS в обратном и прямом пространстве, а также методом XANES. XANES-спектры на L3-крае поглощения Pb демонстрируют близкое сходство для растворов со свинцом и с добавлением аптамера GT. Представлены модули Фурье-преобразования от EXAFS функций k3χ(k) выше L3-края поглощения Pb для растворов со свинцом и с добавлением аптамера GT. Первый пик Фурье-преобразования соответствует ближайшей координационной сфере Pb-O вокруг атомов Pb. XANES-спектр демонстрирует на L3-крае поглощения Hg, пик, расположенный между 12.25 и 12.35 кэВ, что может свидетельствовать на наличие ионов Hg (II). Качественный анализ EXAFS-спектра указывает на то, что химическое окружение атомов ртути подобно окружению в HgO. По результатам МУРР было установлено, что комплексы аптамера с разными тяжелыми металлами имеют различные пространственные параметры и образованы разными формами аптамера: мономерной – для ионов ртути и димерной – для ионов свинца, что подтверждает специфичность взаимодействия аптамера с этими ионами. Для комплексов аптамера с ионами ртути (II), были смоделированы два конформера: T4-Hg-T8 и T4-Hg-T12. Сравнение теоретических моделей с экспериментальными данными МУРР в программах ATSAS, PEPSI-SAXS и WAXSiS показало, что аптамер находится в растворе в двух конформацияхс преобладанием T4-Hg-T8. Для комплексов аптамера с ионами свинца (II) были рассмотрены модели квадруплекса-мономера и квадруплекса-димера. Высокие значения невязки χ2 для модели квадруплекса-мономера показывают, что аптамер GT не образует такой тип квадруплекса ни при каких соотношениях аптамера и соли металла. В растворе с избытком ионов свинца (II), преобладающая форма аптамера имеет параметры близкие к димеру-квадруплексу, сформированному ионами свинца. Для всех моделей комплексов аптамера GT с ионами тяжелых металлов были проведены расчёты молекулярной динамики (МД) продолжительностью 200 нс (GROMACS/Amber14sb/TIP3P). Модели комплексов, показавших лучшее совпадение с данными МУРР, были исследованы методам квантовой химии. Для аптамера с ионами ртути была выбрана модель T4-Hg-T8, для аптамера с ионами свинца была выбрана модель квадруплекса-димера. Для анализа из структур комплексов были вырезаны азотистые основания, непосредственно взаимодействующие с ионами металлов. Оптимизацию геометрии провели методом DFT/B3LYP, базис 6-31Gss для C, N, O, H и базис def2-TZVPP для Hg и Pb. Расстояние N-Hg составило 2,04Å, O4-Hg: 2,03 Å, O2-Hg: 3,10 Å, угол N−Hg−N составил 179о. Энергия связи составила 138.1 ккал/моль. Показано, что основной вклад в энергию связи вносит электростатическое взаимодействие. Каждый катион Pb2+ координирует восемь атомов O. Расстояние между кислородами гуанинов из первой G4-1 и второй G4-2 плоскости и свинцом не превышает 3,5 Å, в то время как расстояние между свинцом и кислородами гуанинов из второй G4-2 и третьей G4-3 плоскости достигает 4,0 Å. Показано, что энергия взаимодействия составляет 117,5 ккал/моль, основной вклад в энергию связи вносит электростатическое взаимодействие. Для комплекса аптамера LC-50 к раку лёгкого проведены измерения МУРР на станции P12 BioSAXS в синхротронном центре DESY, Гамбург, Германия. Анализ показал наличие в растворе двух фракций. Для аптамера LC-50 и для комплекса аптамер-белок были получены спектры ГКР. Симметричные растяжения O-P-O связей, C-N колебания, деформационные колебания С-Н, валентные колебания СН связи, асимметричные колебания =СН3 связи свидетельствуют об образовании специфического связывания молекул. На станции СТМ в НИЦ “Курчатовский институт” получены тонкие структуры спектров осцилляций коэффициента поглощения методами EXAFS в прямом и обратном пространстве и XANES. По результатам молекулярного моделирования методами докинга (HDOCK), молекулярной динамики (GROMACS, Amber14sb/TIP3P) и квантовой химии (GAMESS(US), DFTB3/FMO2/3ob/6-31ss) получены полноатомные модели комплекса LC-50/мишень. Для моделей М2 (χ2 = 1,69) и М5 (χ2 = 2,69) получены списки пар аминокислота-нуклеотид, образующих водородные связи. Аминокислоты ARG 127, ARG 129, ASP 133 и нуклеотиды G 5, G 35, T 36 входят в сайт связывания в обеих рассмотренных моделях. PIEDA анализ (RI-MP2/cc-pVDZ/PCM) показал наибольший вклад электростатического взаимодействия в связывание аптамера с белком. Эксперименты МУРР показали, что максимальный размер комплекса Apt31/RBD равен 15 нм, соответствует объёму частицы с молекулярной массой 40-52 кДа. Измерения спектров гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) подтверждают формирование комплекса аптамер/белок. Сайт связывания аптамера с белком были определены методами молекулярного моделирования: докинга (HDOCK), молекулярной динамики (GROMACS, Amber14sb/TIP3P) и квантовой химии (GAMESS(US), DFTB3/FMO2/3ob/6-31ss). В образовании водородных связей в полученных кластерах учувствуют аминокислоты ARG 408, THR 385 и THR 376. Полная энергия взаимодействия RBD-аптамер составила -221.6 ккал/моль, а для комплекса Apt 31 (2) Etotal= -152.2 ккал/моль. Наиболее сильные взаимодействия наблюдаются для пар фрагментов G14-Tyr369, G14-Ser373, T15-Lys378, Phr374-T12 и Arg408-T23 для комплекса RBD/Apt31 (1). Для второго комплекса RBD/Apt31 (2), наиболее сильные взаимодействия наблюдаются для пар фрагментов T12-Thr376, T12-Phr377, T16-Thr385, Lys378-T11 и Arg408-C25. Установлено, что для комплексов преобладают сильные электростатические взаимодействия,. Основное взаимодействие происходит между отрицательно заряженными фосфатными группами основной цепи дуплекса аптамера и положительно заряженными областями RBD. Структуры комплексов аптамера LC_50 с мишенью и аптамера Apt-31 с RBD были подготовлены для расчета молекулярного электростатического потенциала с использованием программы PDB2PQR и континуального электростатического силового поля PARSE. Оценка распределения зарядов в молекулах аптамеров и белков проведена с помощью плагина APBS реализованного в программе PyMOL. Оба аптамера LC_50 и Apt31 образуют сильный отрицательный заряд по всей структуре из-за наличия фосфатных групп. При этом место связывания на их белковых мишенях имеет положительный заряд, т.е. основное взаимодействие аптамеров с белками обусловлено сильным электростатическим притяжением. Результаты FMO/PIEDA анализа показали, что электростатическое притяжение имеет наибольший вклад в результирующее взаимодействие аптамеров LC_50 с мишенью и Apt31 с RBD-белком.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проект 2023-го года был нацелен на изучение конформационных зависимостей биомолекул ДНК-аптамеров от внешних условий раствора и оценка применимости выбранных методов для исследования данных характеристик. Для этого были исследованы два аптамера, 12D к белку интерлейкину-6 и tNSP3 к N-белку SARS-CoV-2, в растворах с различным содержанием солей в буферном растворе, при различных температурах (25°C и 37°C) и pH методами малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР). Проведена разработка держателя жидкого образца объёмом порядка одного микролитра с целью получения сигнала малоуглового рассеяния, свободного от паразитного рассеяния и обеспечивающего возможность регистрации максимального количества рассеянного излучения с целью получения наилучшего отношения сигнал/шум. Данная модификация является более подходящей по сравнению с предыдущей версией держателя. Выявлено, что структуры аптамера 12D в растворах PBS с добавлением Ca2+ или Mg2+ довольно близки по размеру и форме молекулы, т.е. структура не изменяются не зависят от типа иона в растворе. При увеличении pH до 8.0 наблюдается снижение интенсивности рассеяния на малых углах. При повышении температуры до 37°С нивелируется разница между pH 6.8 и 7.4. Аптамер tNSP3 стабилен в растворе, на сигнал МУРР данных молекул влияют в основном только концентрационные эффекты, в том числе при высоких значения pH, при этом не меняя конформацию аптамера. Проведены измерения спектров кругового дихроизма (КД) при трёх различных значениях pH: 6.8, 7.4 и 8.0 при температуре 25 °С и 37 °С. Полученные спектры не содержат пиков, характерных для квадруплексных структур. Более того, характер кривых не меняется при изменении температуры, pH и концентрации ионов. Т.е. аптамеры tNSP3 и 12D не образуют квадруплексов. С помощью компьютерного моделирования получены вторичные структуры аптамеров с учетом экспериментальных условий. На основе вторичных структур смоделированы полноатомные модели ДНК-аптамеров. Интеграция молекулярного моделирования и синхротронного спектрального метода позволили получить недоступную для экспериментов информацию о пространственной структуре аптамеров и комплексов. Модель комплекса IL-6/ 12D эксперименту подтверждается малым значением невязки между теоретической кривой МУРР и экспериментальными данными, χ2 = 2.375. Сравнение экспериментальной кривой МУРР для комплекса N-белка с аптамером tNSP3 с теоретической дало сравнительно низкое значение невязки, χ2 = 2.176, что можно считать близким совпадением модели с экспериментом, как и для первого аптамер-белкового комплекса. По результатам как молекулярного моделирования, так и экспериментов МУРР, наблюдается образование надмолекулярных комплексов распознающих элементов ДНК-аптамеров с их белковыми мишенями довольно компактной формы. Это свидетельствует о плотном связывании молекул аптамеров с белками, то есть наличии значимых сайтов связывания, обеспечивающих высокую аффинность. С помощью квантовохимических расчётов (FMO/DFTB) получены данные взаимодействия аптамера с его белковыми мишенями. PIEDA анализа показал, что наибольший вклад в связывание аптамера tNSP3 с N белком SARS-CoV-2 вносят электростатические и дисперсионные взаимодействия. Комплекс tNSP3/N-белок при 25 °C имеет почти в два раза больше водородных связей, чем при 37°C. Полная энергия взаимодействия ( Eint) между N-белком SARS-CoV-2 и аптамером tNSP3 при 25°C и при 37°C практически не изменяется (около -550 ккал/моль). Таким образом, в случае комплекса tNSP3/N-белок изменение температуры в рассмотренном диапазоне не оказывает значительного влияния на связывание. Для комплекса интерлейкин-6 (IL-6) и аптамера 12D, наибольший вклад в результирующее взаимодействие белком и аптамером вносит дисперсионные и электростатические взаимодействие. При 25°C и при температуре 37°C количество водородных связей не изменяется. В образовании водородных связей с нуклеотидами участвуют заряженные аминокислоты (Lys, Arg) и полярная незаряженная кислота (Asn). Для комплексов IL-6/12D при 25°C и 37°C значение Eint составляют -187,46 ккал/моль и -392,66 ккал/моль, соответственно. Таким образом, для комплекса IL-6/12D связывание с белком возможно при обеих температурах. Проведена оценка распределения зарядов в молекулах аптамеров и белков, и их комплексов.По полученным результатам моделирования комплексов аптамера tNSP3 с N- белком и аптамера 12D с IL-6 видно, что основные сайты связывания практически не изменяются при различных температурах, аптамеры в обоих комплексах преимущественно связываются с положительно заряженными участками белков. Для измерения связывания аптамеров с белками использовали поляризацию флуоресценции и метод биослойной интерферометрии. В оптимальных условиях в фосфатном буфере с ионами кальция и магния при рН 7,4 и 25°C KD=51,9 нМ. Изменение рН до 6 приводило к увеличению константы связывания до KD=180 нМ. В отсутствие ионов активность аптамера снизилась, KD=230 нМ. Таким образом, на связывание аптамера 12D с интелейкином 6 влияло наличие ионов металлов в среде и рН, но не температура. Для аптамера tNSP3 при связывании с N-белком KD 7,52 ± 0,50 нМ. Связывание аптамера tNSP3 с N-белком не зависело от температуры.