Разработка универсальной биологической платформы для упаковки и целевой доставки систем генетического редактирования CRISPR/Cas

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 20-15-00373

НазваниеРазработка универсальной биологической платформы для упаковки и целевой доставки систем генетического редактирования CRISPR/Cas

Руководитель Чуланов Владимир Петрович, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет) , г Москва

Конкурс №45 - Конкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова CRISPR/Cas9, Cas9, генетическое редактирование, противовирусные препараты, упаковка, целевая доставка, наночастицы, экзосомы, везикулы, вирус гепатита В

Код ГРНТИ76.03.41

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Системы генетического редактирования CRISPR/Cas являются перспективными инструментами для создания новых методов терапии, прежде всего неизлечимых заболеваний. Имеются сообщения об успешном применении CRISPR/Cas для исправления генетических мутаций (Gehrke et al., 2018), создания противовирусных средств (Kostyushev, Brezgin, et al., 2019; Ramanan et al., 2015) и восстановления нарушенной функции генов (Yin et al., 2016). Принцип действия CRISPR/Cas состоит в привлечении белка-нуклеазы Cas к заданной нуклеотидной последовательности за счет короткого специфичного РНК-проводника (прРНК). Белок Cas распознает целевую последовательность и вносит двуцепочечный разрыв в ДНК, который может репарироваться системами клетки с образованием делеций и вставок нуклеотидов (Jinek et al., 2012). Несмотря на эффективность систем, одним из главных препятствий, ограничивающих практическое использование систем генетического редактирования, является отсутствие эффективных методов доставки комплексов Cas-прРНК in vivo. Белки Cas имеют большую молекулярную массу и высокий положительный заряд, которые не позволяют упаковывать их с помощью современных методов нанотехнологии. Условиями идеального метода доставки систем CRISPR/Cas является (а) экранирование комплексов CRISPR/Cas от действия среды (протеаз крови, циркулирующих антител); (б) высокоэффективная доставка и (в) безопасность. На сегодняшний день ни один из методов (липосомы, неорганические наночастицы, пенетрирующие пептиды и пр.) не удовлетворяет сразу всем данным критериям. Наиболее успешные методы доставки с помощью пенетрирующих пептидов (Krishnamurthy et al., 2019), золотых наночастиц (Lee et al., 2017) и наночастиц графена (Yue, Zhou, Cheng, & Xing, 2018) обеспечивают доставку лишь в 20-30% клеток in vivo, не защищают Cas белки от внешних воздействий и вызывают токсические эффекты in vivo. Создание эффективных и безопасных методов упаковки и целевой доставки систем CRISPR/Cas является одним из приоритетов мировой науки. В данном проекте планируется создание универсальной биологической платформы для упаковки систем генетического редактирования CRISPR/Cas с возможностью целевой (таргетированной) доставки. Основой данной платформы будут служить генетически модифицированные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) человека, продуцирующие экзосомы. Экзосомы представляют из себя везикулы размером 50-150 нм (Haraszti et al., 2016), в которые можно упаковать системы CRISPR/Cas. Достоинством экзосом как систем доставки является их высокая биосовместимость, отсутствие собственной токсичности, устойчивость и хорошее биораспределение (D. Liu, Yang, Xiong, & Gu, 2016). Эффективность доставки с помощью экзосом составляет более 85%. Использование экзосом для доставки комплексов Cas-прРНК требует решения ряда задач. Для упаковки и транспорта Cas-белков в экзосомы могут быть использованы взаимодействия WW-Ndfip1, технологии реверсивных белок-белковых взаимодействий (стимул-индуцированная упаковка в экзосомы) и модифицированная технология ChaCha (разрезание линкеров за счет димеризации рецепторов). В работе данные технологии будут апробированы для направленного транспорта Cas-прРНК в экзосомы, что позволит впервые создать универсальные подходы для упаковки систем CRISPR/Cas любой сложности. Вторым направлением Проекта является таргетная доставка комплексов. Программирование поверхности экзосом позволит направлять CRISPR/Cas практически в любой орган и ткань in vivo, включая мозг, печень, почки, легкие и сердце. Это будет достигнуто путем экспрессии в МСК и интеграции в экзосомы слитных конструктов из конститутивных белков экзосом и рецепторов для таргетных клеток. Далее на модели инфекции вирусом гепатита В in vitro и на модели персистенции кольцевой ковалентно замкнутой ДНК вируса in vivo будет проведено тестирование созданных систем доставки. С помощью двух подходов на основе высокоэффективных систем CRISPR/Cas (нуклеаз CRISPR/Cas9 и системы CRISPRa), созданных ранее нашей группой (Kostiushev, Brezgin, Kostyusheva, Zarifyan, & Chulanov, 2018; Kostyushev, Brezgin, et al., 2019), будет проведена оценка противовирусного действия на модели персистенции ДНК вируса гепатита В in vivo с динамической оценкой распределения наночастиц и противовирусного действия с помощью метода In Vivo Live Imaging.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Генетическое редактирование с помощью внеклеточных везикул Gene Editing by Extracellular Vesicles MDPI, Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7362. (год публикации - 2020)
10.3390/ijms21197362

2. Удаление эписомальной ДНК из клеток человека с помощью CRISPRa-опосредованной активации цитидин-дезаминаз Clearing of Foreign Episomal DNA from Human Cells by CRISPRa-Mediated Activation of Cytidine Deaminases MDPI, Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6865 (год публикации - 2020)
10.3390/ijms21186865

3. Анастасия Костюшева, Сергей Брезгин, Дмитрий Костюшев и Владимир Чуланов Ribonucleoprotein complexes of Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas9 rapidly destroy the major form of hepatitis B virus genome Mary Ann Liebert, Inc., publishers, The International CRISPR & Gene Editing Symposium 2020; Победитель постерной сессии (год публикации - 2020)

4. Костюшев Д., Костюшева А., Брезгин С., Бабин Ю., Уткина А., Гоптарь И., Волчкова Е., Чуланов В. Rapid clearance of hepatitis B virus infection using ribonucleoprotein complexes of CRISPR/Cas9: results of in vitro and in vivo studies. Hepatology International, 14, pages1–470(2020) (год публикации - 2020)
10.1007/s12072-020-10030-4

5. Костюшев Д.С., Костюшева А.П., Пономарева Н.И., Брезгин С.А., Чуланов В.П. CRISPR/Cas and Hepatitis B Therapy: Technological Advances and Practical Barriers Nucleic Acid Therapeutics, Online ahead of print (год публикации - 2021)
10.1089/nat.2021.0075

6. Чуланов В.П., Костюшева А.П., Брезгин С.А., Пономарева Н.И., Гегечкори В.И., Волчкова Е.В., Пименов Н.Н., Костюшев Д.С. CRISPR Screening: Molecular Tools for Studying Virus–Host Interactions Viruses, 13(11), 2258 (год публикации - 2021)
10.3390/v13112258

7. Пономарева Н.И., Костюшева А.П., Брезгин С.А., Смирнов В.В., Гегечкори В.И., Костюшев Д.С., Чуланов В.П. СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОСОМ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Биомедицина, Том 17, № 3E (год публикации - 2021)
10.33647/2713-0428-17-3E-76-79

8. Брезгин С.А., Костюшева А.П., Пономарёва Н.И., Волчкова Е.В., Костюшев Д.С., Чуланов В.П. Ингибиторы обратной транскрипции подавляют восстановление пула кольцевой ковалентно-замкнутой ДНК вируса гепатита В после действия нуклеаз CRISPR-Cas Сборник тезисов XIII Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням имени академика В.И.Покровского Инфекционные болезни в современном мире: текущие и будущие угрозы, Сборник трудов ХIII Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням имени академика В.И. Покровского; IV Всероссийской научно-практической конференции; VI Всероссийского симпозиума. Москва, 2021 (год публикации - 2021)

9. Владимир Чуланов и Дмитрий Костюшев Virological cure of chronic hepatitis B virus infection: from «Is it possible?» to «When?» Infectious Agents and Cancer, Infectious Agents and Cancer 2022, 17(Suppl 1): PL11 (год публикации - 2022)

10. Сергей Бацких, Сергей Морозов, Алексей Дорофеев, Жанна Борунова, Дмитрий Костюшев, Сергей Брезгин, Анастасия Костюшева, Владимир Чуланов Previous hepatitis B viral infection–an underestimated cause of pancreatic cancer World Journal of Gastroenterology, 28(33): 4812-4822 (год публикации - 2022)
10.3748/wjg.v28.i33.4812

11. Сергей Бацких, Сергей Морозов и Дмитрий Костюшев Hepatitis B virus markers in hepatitis B surface antigen negative patients with pancreatic cancer: Two case reports World Journal of Hepatology, 14(7): 1512–1519 (год публикации - 2022)
10.4254/wjh.v14.i7.1512

12. А.П. Костюшева, С.А. Брезгин, Н.И. Пономарева, И.А. Гоптарь, А.В. Никифорова, В.И. Гегечкори, В.Б. Полэуктова, К.А. Туркадзе, А.Е. Судьина, В.П. Чуланов, Д.С. Костюшев Противовирусное действие рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas9 на модели вируса гепатита В in vivo Молекулярная Биология, Том 56(2022) №6 стр. 884-891 (год публикации - 2022)
10.31857/S002689842206012X

13. КОСТЮШЕВА АНАСТАСИЯ ПАВЛОВНА, ПОНОМАРЕВА НАТАЛЬЯ ИГОРЕВНА, БРЕЗГИН СЕРГЕЙ, ЛУКАШЕВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ, ЧУЛАНОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ, КОСТЮШЕВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ ЭЛИМИНАЦИЯ ГЕПАТИТА В С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫХ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫМИ КОМПЛЕКСАМИ CRISPR/CAS9 СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА, СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА, стр. 105 (год публикации - 2022)

14. Дмитрий Сергеевич Костюшев, Сергей Брезгин, Анастасия Павловна Костюшева, Наталья Игоревна Пономарева, Георгий Владимирович Максимов, ОВ Слатинская, Александр Николаевич Лукашев, Владимир Петрович Чуланов Разработка программируемых биологических наночастиц для упаковки и целевой доставки CRISPR/Cas-систем: испытания на модели вируса гепатита В СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА, СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА, стр. 104 (год публикации - 2022)

15. Анастасия Костюшева, Сергей Брезгин, Наталья Пономарева, Екатерина Баюрова, Ирина Гоптарь, Анастасия Никифорова, Анна Судьина, Илья Гордейч Rebound of HBV replication followed by transient CRISPR/Cas9 RNPs and its prevention by rcDNA depletion Infectious Agents and Cancer, Infectious Agents and Cancer 2022, 17(Suppl 1): O20 (год публикации - 2022)

16. Сергей Брезгин, Анастасия Костюшева, Наталья Пономарева, Екатерина Баюрова, Ирина Гоптарь, Анастасия Никифорова, Анна Судьина, Илья Гордейчук, Ольга Слатинская, Георгий Максимов, Анастасия Фролова, Владимир Чуланов и Дмитрий Костюшев Tools and technologies for inducible and reversible packaging of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes and their targeted delivery by biological nanoparticles Infectious Agents and Cancer, Infectious Agents and Cancer 2022, 17(Suppl 1): P7 (год публикации - 2022)

17. ПОНОМАРЕВА Н.И., БРЕЗГИН С.А., КОСТЮШЕВА А.П., СЛАТИНСКАЯ О.В., МАКСИМОВ Г.В., ЛУКАШЕВ А.Н., ЧУЛАНОВ В.П., КОСТЮШЕВ Д.С. ДОСТАВКА РНК С ПОМОЩЬЮ ГИБРИДНЫХ ЛИПОСОМ-ЭКЗОСОМ СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА, КОНФЕРЕНЦИЯ: СИНТЕТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОФАРМАЦЕВТИКА Новосибирск, 24–28 июля 2022 года (год публикации - 2022)

Публикации