КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 20-15-00373

НазваниеРазработка универсальной биологической платформы для упаковки и целевой доставки систем генетического редактирования CRISPR/Cas

РуководительЧуланов Владимир Петрович, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2020 г. - 2022 г.

, продлен на 2023 - 2024. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№45 - Конкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые словаCRISPR/Cas9, Cas9, генетическое редактирование, противовирусные препараты, упаковка, целевая доставка, наночастицы, экзосомы, везикулы, вирус гепатита В

Код ГРНТИ76.03.41

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Системы генетического редактирования CRISPR/Cas являются перспективными инструментами для создания новых методов терапии, прежде всего неизлечимых заболеваний. Имеются сообщения об успешном применении CRISPR/Cas для исправления генетических мутаций (Gehrke et al., 2018), создания противовирусных средств (Kostyushev, Brezgin, et al., 2019; Ramanan et al., 2015) и восстановления нарушенной функции генов (Yin et al., 2016). Принцип действия CRISPR/Cas состоит в привлечении белка-нуклеазы Cas к заданной нуклеотидной последовательности за счет короткого специфичного РНК-проводника (прРНК). Белок Cas распознает целевую последовательность и вносит двуцепочечный разрыв в ДНК, который может репарироваться системами клетки с образованием делеций и вставок нуклеотидов (Jinek et al., 2012). Несмотря на эффективность систем, одним из главных препятствий, ограничивающих практическое использование систем генетического редактирования, является отсутствие эффективных методов доставки комплексов Cas-прРНК in vivo. Белки Cas имеют большую молекулярную массу и высокий положительный заряд, которые не позволяют упаковывать их с помощью современных методов нанотехнологии. Условиями идеального метода доставки систем CRISPR/Cas является (а) экранирование комплексов CRISPR/Cas от действия среды (протеаз крови, циркулирующих антител); (б) высокоэффективная доставка и (в) безопасность. На сегодняшний день ни один из методов (липосомы, неорганические наночастицы, пенетрирующие пептиды и пр.) не удовлетворяет сразу всем данным критериям. Наиболее успешные методы доставки с помощью пенетрирующих пептидов (Krishnamurthy et al., 2019), золотых наночастиц (Lee et al., 2017) и наночастиц графена (Yue, Zhou, Cheng, & Xing, 2018) обеспечивают доставку лишь в 20-30% клеток in vivo, не защищают Cas белки от внешних воздействий и вызывают токсические эффекты in vivo. Создание эффективных и безопасных методов упаковки и целевой доставки систем CRISPR/Cas является одним из приоритетов мировой науки. В данном проекте планируется создание универсальной биологической платформы для упаковки систем генетического редактирования CRISPR/Cas с возможностью целевой (таргетированной) доставки. Основой данной платформы будут служить генетически модифицированные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) человека, продуцирующие экзосомы. Экзосомы представляют из себя везикулы размером 50-150 нм (Haraszti et al., 2016), в которые можно упаковать системы CRISPR/Cas. Достоинством экзосом как систем доставки является их высокая биосовместимость, отсутствие собственной токсичности, устойчивость и хорошее биораспределение (D. Liu, Yang, Xiong, & Gu, 2016). Эффективность доставки с помощью экзосом составляет более 85%. Использование экзосом для доставки комплексов Cas-прРНК требует решения ряда задач. Для упаковки и транспорта Cas-белков в экзосомы могут быть использованы взаимодействия WW-Ndfip1, технологии реверсивных белок-белковых взаимодействий (стимул-индуцированная упаковка в экзосомы) и модифицированная технология ChaCha (разрезание линкеров за счет димеризации рецепторов). В работе данные технологии будут апробированы для направленного транспорта Cas-прРНК в экзосомы, что позволит впервые создать универсальные подходы для упаковки систем CRISPR/Cas любой сложности. Вторым направлением Проекта является таргетная доставка комплексов. Программирование поверхности экзосом позволит направлять CRISPR/Cas практически в любой орган и ткань in vivo, включая мозг, печень, почки, легкие и сердце. Это будет достигнуто путем экспрессии в МСК и интеграции в экзосомы слитных конструктов из конститутивных белков экзосом и рецепторов для таргетных клеток. Далее на модели инфекции вирусом гепатита В in vitro и на модели персистенции кольцевой ковалентно замкнутой ДНК вируса in vivo будет проведено тестирование созданных систем доставки. С помощью двух подходов на основе высокоэффективных систем CRISPR/Cas (нуклеаз CRISPR/Cas9 и системы CRISPRa), созданных ранее нашей группой (Kostiushev, Brezgin, Kostyusheva, Zarifyan, & Chulanov, 2018; Kostyushev, Brezgin, et al., 2019), будет проведена оценка противовирусного действия на модели персистенции ДНК вируса гепатита В in vivo с динамической оценкой распределения наночастиц и противовирусного действия с помощью метода In Vivo Live Imaging.

Ожидаемые результаты
Изучена возможность естественного транспорта РНП CRISPR/Cas в экзосомы, продуцируемые раковыми и нетрансформированными клетками человека. С помощью протеомного анализа определены особенности в белковом составе экзосом и модификациях Cas-белков. Определение особенностей транспорта РНП CRISPR/Cas в экзосомы может быть использовано для разработки технологий направленной упаковки систем генетического редактирования в секретируемые in vitro нановезикулы. Различные технологии реверсивных белок-белковых взаимодействий, технологий «модуля контроля» и стимул-индуцированного высвобождения белков впервые будут адаптированы для упаковки двух принципиально различных систем CRISPR/Cas (систем нуклеаз CRISPR/Cas9 и системы активации транскрипции CRISPRa). На основе биологических платформ будут созданы нановезикулы с исключительными параметрами биосовместимости, уже подтвержденными ранее по результатам клинических испытаний (Hong, Yang, Wu, Li, & Tang, 2019). Использованные нановезикулы имеют естественную способность эффективно преодолевать биологические барьеры, включая цитоплазматическую мембрану клеток и гематоэнцефалический барьер (Ha, Yang, & Nadithe, 2016). Создание универсальных механизмов транспорта компонентов CRISPR/Cas в экзосомы предоставит уникальную возможность для доставки любых существующих и перспективных систем генетического редактирования и их генно-инженерных вариантов in vivo в биомедицинских целях. Используя методы программирования поверхности, будут получены различные варианты нановезикул, направляющие карго (системы CRISPR/Cas) в клетки мозга, печени, почки, легких и сердца. Высокочувствительная технология визуализации сигнала люциферазы In Vivo Live Imaging (IVIS) будет использована для оценки доставки карго нановезикул в организме мышей in vivo. Методами секвенирования нового поколения будет проведена оценка генетических модификаций в целевых клетках. Ни в одной из опубликованных на сегодняшний день работ доставка CRISPR/Cas не была эффективно осуществлена ни в один из перечисленных органов. Отмеченная руководством Национальных Институтов Здоровья США как прорывная, пептидная технология доставки классической системы нуклеаз CRISPR/Cas в клетки легочного эпителия обеспечивает всего около 30% генетического редактирования in vivo (Krishnamurthy et al., 2019). Созданные нановезикулы с программируемой поверхностью будут использованы для упаковки системы высокоспецифичных и эффективных нуклеаз CRISPR/Cas9 от организма Streptococcus thermophilus и системы активации транскрипции противовирусных факторов APOBEC3s CRISPRa. Эффективность действия нуклеаз CRISPR/Cas9 и системы CRISPRa будет протестирована in vivo на модели вируса гепатита В, одного из самых распространенных вирусных заболеваний в мире, из-за последствий которого в год погибает более 1 миллиона человек. Создание метода полного излечения инфекции вируса гепатита В – одна из ключевых задач мирового здравоохранения. В совокупности, результатами Проекта станут передовые разработки в области генетического редактирования прикладного характера, которые позволят подходам на основе CRISPR/Cas перейти из области экспериментальных разработок в разряд экспериментальных лекарственных средств.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---