Ольга Понаморева и Борис Носков о новых решениях в области белковой инженерии

Ольга Понаморева: «Мы не просто изучаем природу — мы пытаемся заставить ее работать на благо человека»

В белковой инженерии есть несколько направлений работы. Самым известным можно назвать рациональный дизайн белков — совокупность методов, когда исходя из желаемых свойств и знания структуры белка в него вносятся изменения, которые приводят к изменению свойств в нужном направлении. Другой важный метод, центральный в нашем проекте — это гетерологичная экспрессия, когда ген белка из одного организма начинает работать в другом. Мы берем гены оксидаз у солелюбивых микроорганизмов — бактерий и архей — и производим белки в кишечной палочке. Хотя она быстро растет и удобна в работе, получить активные сложные ферменты все еще непросто.

Сегодня мы плавно переходим от скрининга природных ферментов к их целенаправленному конструированию. В области белковой инженерии публикуется огромное количество статей об улучшении свойств самых разных ферментов. Большая часть публикаций — это проверка достаточно простых предположений о том, что несколько аминокислотных замен способны сильно изменить свойства фермента. Однако наблюдается тенденция к описанию все более многостадийных процессов оптимизации белков, где заменам могут подвергаться десятки аминокислот, что значительно меняет свойства фермента. 

Источник: авторы исследования

Мы занимаемся медьсодержащими оксидазами — ферментами с атомами меди. Это природные катализаторы, которые с помощью меди безопасно окисляют вещества, используя кислород воздуха. Мы думаем, что в скором времени некоторые из них, например лакказы и билирубиноксидазы с улучшенными свойствами, а также биосенсоры и каталитические системы на их основе станут доступным коммерческим товаром.

Мы работаем в этом направлении: не просто изучаем природу — мы пытаемся заставить ее работать на благо человека. С помощью методов биоинформатики мы «просматриваем» геномы микроорганизмов в поисках перспективных генов и стремимся предсказать способности белка, еще не держа его в руках. Особое внимание уделяем тем белкам, которые умеют окислять билирубин, поскольку это важно для медицинской диагностики. Мало найти ген — нужно заставить кишечную палочку или дрожжи производить наш фермент в промышленных масштабах. Какое-то время мы пробовали использовать дрожжи, но затем вновь вернулись к кишечной палочке. В отличие от грибных, наши лакказы оказались любителями щелочной среды. Это открывает дорогу для промышленного применения ферментов.

В работе нам помогает искусственный интеллект. С помощью известного алгоритма AlphaFold2 мы строим трехмерные модели ферментов, чтобы выявлять ключевые элементы в структуре белков, определяющие их свойства.

Таким образом, мы создали около двух десятков генетических конструкций для производства ферментов из архей и бактерий и поняли главное: каждый белок требует индивидуального подхода. Архейные белки — неженки, им нельзя давать слишком много свободы, иначе они слипаются в бессмысленные комки. Нужен жесткий контроль синтеза. Бактериальные трехдоменные лакказы — тяжеловесы, им нужна мощная поддержка (суперпродуктивные штаммы) и помощь шаперонов — молекулярных «нянек». Мы вывели целую науку подбора правильной пары «вектор — штамм — хозяин», что похоже на подбор ключа к сложному замку.

Самые удачные ферменты мы испытываем в реальных задачах: определяем билирубин в сыворотке крови, создаем новые биоматериалы и параллельно пытаемся собрать биокатод для ферментного биотопливного элемента.

Мы впервые доказали, что актинобактериальные малые лакказы окисляют билирубин даже эффективнее, чем коммерческая специализированная билирубиноксидаза. Это настоящий прорыв: возможно, именно они станут основой для новых точных тестов на билирубин — тест, который проводят для оценки работы печени, желчевыводящих путей и выявления причин желтухи у новорожденных.

Кроме того, мы занимаемся биоматериалами, перспективными в качестве ранозаживляющих повязок и съедобной упаковки для продуктов. Лакказы окисляют полифенолы, которые после этого способны взаимодействовать с природными полисахаридами, например с хитозаном. Гидрогели хитозана обладают антимикробными свойствами, поэтому используются в качестве ранозаживляющего материала. Дополнительная сшивка биополимеров природными (растительными) полифенолами при участии лакказ одновременно улучшает механические характеристики биоматериала и придает ему антиоксидантные свойства. Нам удалось добиться 85% сшивки хитозана с феруловой кислотой и получить новый биоматериал с такими свойствами. Лакказа выступила в роли «молнии», соединив две молекулы особым образом, чтобы сохранить все полезные качества.

Научный коллектив под руководством Ольги Понаморевой. Источник: авторы исследования

И самая красивая победа. Долгое время считалось, что двухдоменные лакказы не способны к прямому переносу электронов на электрод — они просто не умеют на него правильно садиться. Мы организовали «нафтильный ключ»: покрыли электрод ароматическими молекулами, похожими на любимый субстрат фермента, и лакказа села на него идеально. В результате мы получили прямой перенос электронов при потенциале +0,64 В, а это уровень элитных грибных ферментов! Система оказалась еще стабильной и термоустойчивой.

Но самые интересные открытия — впереди.

Борис Носков: «Растительные белки и их нанофибриллы начинают использоваться для создания биодеградируемых материалов, эффективных стабилизаторов пен и эмульсий»

Наш коллектив уже достаточно давно изучает поведение белков на поверхности воды. Это помогает понять, как работают клеточные мембраны, что важно для самых разных фундаментальных и прикладных задач.

Поверхностные явления в водных системах, содержащих белки, начали привлекать внимание исследователей более ста лет назад. В тридцатые годы прошлого века известный ученый Ирвинг Ленгмюр предположил: когда белок попадает на водную поверхность, компактная структура его молекул разрушается и на поверхности образуется тонкая пленка, состоящая из развернутых молекул. В конце XX века эти представления поставили под сомнение: метод отражения нейтронов показал, что при соприкосновении с водой белки могут сохранять часть своей первоначальной структуры. Поскольку этот метод дорог и малодоступен, наша группа в начале 2000-х применила более простые подходы, основанные на регистрации реакции поверхности на малые колебания ее площади. Эти исследования позволили опровергнуть выводы Ленгмюра и расширили возможности изучения белковых систем. Сегодня исследования в нашей области идут по двум направлениям: изучение поведения амилоидных фибрилл и растительных белков на поверхности жидкости.

Коллектив исследователей: доцент Александр Михайлов, доцент Ольга Миляева, аспирант Анастасия Рафикова, ведущий научный сотрудник Алексей Быков. Источник: Борис Носков

Раньше амилоидные фибриллы — нитевидные агрегаты — изучали преимущественно в связи с их возникновением при тяжелых заболеваниях. Однако оказалось, что фибриллы широко распространены в природе и в большинстве случаев безопасны. Более того, из-за своей высокой прочности они могут быть перспективным материалом для практических применений. При этом поверхностные свойства их растворов изучены слабо и основные работы здесь принадлежат нашей группе.

Второе направление — пленки растительных белков. Традиционно эти белки привлекали немного внимания: хуже растворяются в воде, слабее удерживаются на водной поверхности, их сложнее очищать. В настоящее время становится ясно: устойчивое развитие невозможно без частичной замены животных белков более дешевыми растительными аналогами. Кроме того, производство растительных белков наносит меньший ущерб экологии. Причем речь идет не только о пище: из отходов растениеводства можно извлекать белки для использования в промышленности. Например, на их основе создают биоразлагаемые пластмассы.

При использовании белков ключевую роль играют свойства их межфазных слоев и тонких пленок на водной поверхности. Это важно при создании разлагаемых в природе материалов, микрокапсул для доставки лекарств, а также при стабилизации пен и эмульсий в фармацевтике, косметике и пищевой промышленности. Поскольку растительные белки недостаточно эффективны для этих целей, ученые ищут способы улучшить их свойства. Но есть другой путь: можно вместо исходных растительных белков использовать их нанофибриллы — структуры, в которые эти белки могут самоорганизоваться, образуя очень тонкие волокна. Такие наночастицы имеют более высокую поверхностную активность, чем молекулы растительных белков. Этот вывод стал одним из результатов поддержанного РНФ проекта.

Растительные белки из разных источников сильно различаются, поэтому важно устанавливать связь между их структурой и свойствами — это одна из задач наших текущих исследований. Фибриллы могут образовывать комплексы с другими веществами, меняя свойства поверхностных пленок. Недавние работы нашей группы показали: добавки некоторых полиэлектролитов значительно повышают динамическую поверхностную упругость — ключевой параметр, определяющий стабильность пенных и эмульсионных пленок. Это открывает новые пути применения белковых фибрилл. Последовательное нанесение на поверхность слоев с противоположными зарядами (фибрилл или фибрилл и полиэлектролита) позволяет создавать прочные многослойные пленки — основу для микрокапсул. Такие пленки можно переносить на твердые поверхности, формируя материалы с заданной микроструктурой.

Коллектив исследователей (слева направо): аспирант Николай Исаков, студент Дмитрий Ангел, профессор Борис Носков, доцент Ольга Миляева, студент Егор Цыганов, аспирант Анастасия Рафикова, ведущий научный сотрудник Алексей Быков. Источник: Борис Носков

Еще одно направление нашей работы — создание неупорядоченных белковых частиц, микрогелей. Они также стабилизируют пены и эмульсии, а получать их, по предварительным данным, проще, чем фибриллярные агрегаты.

Другая амбициозная задача — разработка синтетических аналогов легочных сурфактантов. Внутренняя поверхность легких покрыта пленкой из белков и липидов, обеспечивающей нормальное дыхание. Нарушения в этом комплексе ведут к болезням, которые сейчас лечат препаратами на основе вытяжки из легких животных. Чтобы создать искусственный аналог, нужно понять, как именно белки работают в альвеолах. Наши исследования показали: белки ускоряют обмен липидами между поверхностью и объемом жидкости при растяжении и сжатии пленки. Эти данные помогают формулировать требования к синтетическим сурфактантам будущего.