Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Согласно рабочей гипотезе Проекта, движущей силой патогенеза болезни Альцгеймера (БА) являются амилоидные матрицы - межмолекулярные комплексы изоформ бета-амилоида (Aβ), с одной стороны, и белков-партнеров, с другой, - которые служат зародышами церебрального амилоидогенеза (т.е. патологической агрегации интактных молекул Aβ в тканях мозга) и инициируют процессы нейродегенерации при БА [1]. Амилоидные матрицы рассматриваются нами в качестве фармакологических мишеней для создании новой стратегии лечения БА. В основе этой стратегии лежит направленное подавление образования и разрушение амилоидных матриц молекулярными агентами, которые специфически связываются с аминокислотными участкам в интерфейсах матриц. Основной решаемой задачей на этапе 2019 г. было установление структурно-функциональных характеристик ряда межмолекулярных комплексов изоформ Aβ и белков-партнеров, которые на основании предварительных исследований были выбраны в качестве наиболее вероятных кандидатов на роль амилоидных матриц. Амилоидные матрицы представляли собой двухкомпонентные комплексы, в которых в качестве пептидного компонента были полноразмерные пептиды (длина основной цепи 42 а.о.) интактного Aβ (Aβ(1-42)), изомеризованного по остатку Asp7 Aβ (isoАβ(1-42)), фосфорилированного по остатку Ser8 Aβ (pS8-Аβ(1-42)), Aβ с «Английской» мутацией H6R (H6R-Aбета(1-42)). В качестве второго компонента матриц были следующие белки-партнеры: никотиновые ацетилхолиновые рецепторы подтипов α4β2 (α4β2nAChR) и α7 (α7nAchR), ламинины человека и мыши, Na,K-АТФаза, овечий прион (shPrP) и его N- и С- домены, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД). Образование амилоидной матрицы в присутствии Aβ(1-42), isoАβ(1-42) или pS8-Аβ(1-42) на α4β2nAСhR было определено путем электрофизиологического анализа ответов рецепторов, экспрессированных в ооцитах Xenopus laevis. Найдено, что присутствие ионов Zn2+ стимулирует формирование амилоидных матриц на α4β2nAChR, а фосфорилирование по остатку Ser8 и изомеризация остатка Asp7 являются факторами, препятствующими образованию амилоидных матриц на α4β2nAChR. Установлено, что isoАβ(1-42) сильнее ингибирует α7nAСhR в клетках нейробластомы N2a и SH-SY5Y чем интактный пептид [2]. Усиление ингибирования α7nAchR обуславливает повышенную цитотоксичность isoAβ(1-42) и предотвращает уход рецептора с поверхности клеток. Таким образом, изомеризация Aβ по Asp7 способствует образованию амилоидных матриц на рецепторе α7nAchR. Показано, что Aβ(1-42) и isoАβ(1-42) образуют стабильные комплексы с ламининами -111 и -511 предположительно через интерфейс, образованный участками EVHH и RADD Аβ и ламинина, соответственно. Образование комплексов между ламининами и бета-амилоидными пептидами подавлялось в присутствии как тетрапептида RADD, так и тетрапептида HAEE, которые являются ион-комплементарными участку EVHH Аβ. Значение константы диссоциации (Kd) для комплекса isoAβ(1-42):RADD составило 30 мкМ, что примерно на порядок ниже такового для Aβ(1-42):RADD. Агрегация A(1-42) при взаимодействии с иммобилизованным комплексом ламинин-111:Aβ(1-42) эффективно ингибировалась тетрапептидом RADD. Для проверки роли участка RADD ламинина-111 в образовании амилоидной матрицы, были получены клетки-продуценты белка ламинин-111 и наработан человеческий рекомбинантный ламинин-111, а также клетки-продуценты, производящие ламининовые цепи β1 и γ1, которые будут использованы на следующем этапе Проекта для получения мутантного ламинина-1mut11 путем трансфекции вектором, содержащим мутантную по белковому мотиву RADD последовательность гена LAMA1. Показано, что процесс агрегации Aβ на матрице Na,K-АТФаза-Aβ носит кооперативный характер. Образование амилоидных матриц на молекуле Na,K-АТФазы подтверждается тем, что в присутствии Na,K-АТФазы нарушается Zn2+-зависимая агрегация Aβ(1-42) и его изоформ H6R-Aβ(1-42) и isoAβ(1-42). В присутствии Na,K-АТФазы нарушается также спонтанная агрегация H6R-Aβ(1-42) и isoAβ(1-42) в фибриллы с бета-складчатой структурой. Образование агрегатов Aβ на молекуле Nа,K-АТФазы было продемонстрировано на клетках нейробластомы: наблюдается колоколизация скопления бета-амилоидных пептидов и Na,K-АТФазы. Полученные данные согласуются со сделанным нами ранее выводом [3] о том, что бета-амилоид связывается c внеклеточной частью Na,K-АТФазы. Установлено, что предпочтительной мишенью действия Aβ является экспрессирующаяся во всех типах клеток α1 изоформа каталитической субъединицы фермента, а не тканеспецифичная α3 изоформа, характерная для нейрональных клеток. Поскольку именно α1 изоформа отвечает за реализацию рецепторной функции Na,K-АТФазы, полученные данные хорошо коррелируют с описанной нами ранее активацией сигнальных каскадов бета-амилоидными пептидами [4]. Генноинженерными методами были наработаны образцы как полноразмерного овечьего приона так и его доменов. Определено, что полноразмерный прион (shPrP) и его глобулярный околомембранный С-домен (C-shPrP), в отличие от N-домена приона (N-shPrP), не связываются с иммобилизованным Aβ(1-42). Методом изотермической калориметрии титрования было подтверждено, что N-домен приона специфически связывается с Aβ(1-42) и с isoAβ(1-42). При этом характер взаимодействия пептидов с N-shPr имеет кардинальные различия, которые указывают на то, что isoAβ(1-42) при взаимодействии с прионом в большей степени, чем Aβ(1-42), подвергается олигомеризации и агрегации. Установлено, что как N-домен, так и полноразмерный shPrP индуцируют агрегацию как Aβ(1-42), так и isoAβ(1-42). При этом isoAβ(1-42) агрегирует в гораздо более сильной степени. Из полученных данных следует, что при взаимодействии изоформ бета-амилоида с прионным белком образуется матрица для олигомеризации/агрегации пептида, причем когда в качестве матрицы выступает isoAβ(1-42), то агрегационные процессы усиливаются. Ранее нами было обнаружено, что ГАФД образует ковалентный комплекс с Аβ(1-42), и такой комплекс является зародышем агрегации интактных молекул Аβ(1-42) [Lazarev et al., 2020 Aging Cell, в печати]. Для сравнения токсического действия комплексов ГАФД с различными изоформами Аβ(1-42) были использованы клетки нейробластомы человека SH-SY5Y. Найдено, что наибольшей цитотоксичностью обладает комплекс isoAβ(1-42):ГАФД. Установлено, что это связано с повышенной эффективностью образования комплексов isoАβ(1-42):ГАФД по сравнению с комплексами Аβ(1-42):ГАФД и pS8-Аβ(1-42):ГАФД. Установлено, что Aβ(1-42) и H6R-Aβ(1-42) ингибируют активность изоформ Ate1-1 и Ate1-3 аргинил-трансферазы Ate1. Таким образом, при развитии БА увеличение концентрации амилоидных пептидов и появление их патогенных форм приводит к нарушению функционирования Ate1 и ингибированию деградации белков через убиквитин-протеасомную систему, что, в конечном счете, индуцирует апоптоз нейрональных клеток [5]. Конформационные различия между Аβ(1-42), isoAβ(1-42) и pS8-Аβ(1-42) были исследованы in silico. Сравнительный анализ построенных трехмерных моделей изоформ Аβ выявил, что в структуре всех трех изоформ Aβ наблюдается левая спираль типа полипролин-II, характерная для гибких структур и предпочтительная для участков белок-белковых контактов [6]. Важная особенность этих структур состоит в том, что металл-связывающий сайт 11-EVHH-14 максимально открыт для взаимодействий во всех трех изоформах и по этой причине способен участвовать в образовании амилоидных матриц. Также in silico были построены модели структур следующих белков-партнеров: (1) пентамера нейронального ацетилхолинового рецептора α4β2nAChR и его внеклеточного домена, (2) Na,K-АТФазы человека, (3) человеческого приона, (4) человеческих ламининов -111 и -511. Построены модели цинк-зависимых интерфейсов взаимодействия Aβ на основе начальной конформации хелатирующего участка (11-EVHH-14) Aβ со следующими белками-партнерами: (1) ламинин-111, смоделирован интерфейс взаимодействия с участием иона цинка по сайту RADD и отдельно с RADD; (2) прионный белок, взаимодействие Аβ(1-42) и isoАβ(1-42) с участием иона цинка с расположенными в N-концевом домене октаповторами; (3) внеклеточный домен α4β2nAChR, взаимодействие с участием иона цинка по сайту HAEE. Также построены модели медь-зависимых взаимодействий Аβ(1-42) и isoАβ(1-42) с октаповторами приона человека. Анализ полученных комплексов указывает на то, что в случае isoАβ(1-42) интерфейс взаимодействия заметно нарушен, что, предположительно, приведет к ослаблению взаимодействий пептида с прионным белком. В течение 2019 г. с целью создания экспериментальной базы для тестирования терапевтической эффективности разрабатываемых в рамках выполнения Проекта ингибиторов образования амилоидных матриц были получены образцы меченных тритием пептидов Aβ, для выявления динамики образования амилоидных матриц в модельных животных, и подготовлены необходимые модельные животные и препараты клинического материала. Подготовлены экспериментальные группы мышей (как трансгенных, так и дикого типа), которым начато проведение внутривенных инъекций препаратов синтетического pS8-Аβ(1-42), с целью определения оптимальных условий ингибирования церебрального амилоидогенеза этим пептидом. Разработана методика выделения низкоолигомерной, высокоолигомерной и фибриллярной фракций Aβ из аутопсийного материала, которая в дальнейшем будет использована для получения препаратов зародышей патогенной агрегации Aβ. Создана методика определения количества изомеризованного по Asp7 пептида в биологических образцах, что позволит выявлять присутствие зародышей патогенной агрегации и в перспективе может использоваться как метод диагностики БА [7, 8]. 1. Козин, С. А. & Макаров, А. А. (2019) Конвергенция концепций патогенеза болезни Альцгеймера, Молекулярная биология. 53, 1020 - 1028. 2. Barykin, E. P., Garifulina, A. I., Kruykova, E. V., Spirova, E. N., Anashkina, A. A., Adzhubei, A. A., Shelukhina, I. V., Kasheverov, I. E., Mitkevich, V. A., Kozin, S. A., Hollmann, M., Tsetlin, V. I. & Makarov, A. A. (2019) Isomerization of Asp7 in Beta-Amyloid Enhances Inhibition of the alpha7 Nicotinic Receptor and Promotes Neurotoxicity, Cells. 8. 3. Barykin, E. P., Petrushanko, I. Y., Kozin, S. A., Telegin, G. B., Chernov, A. S., Lopina, O. D., Radko, S. P., Mitkevich, V. A. & Makarov, A. A. (2018) Phosphorylation of the amyloid-beta peptide inhibits zinc-dependent aggregation, prevents Na,K-ATPase inhibition, and reduces cerebral plaque deposition, Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 302. 4. Petrushanko, I. Y., Mitkevich, V. A., Anashkina, A. A., Adzhubei, A. A., Burnysheva, K. M., Lakunina, V. A., Kamanina, Y. V., Dergousova, E. A., Lopina, O. D., Ogunshola, O. O., Bogdanova, A. Y. & Makarov, A. A. (2016) Direct interaction of beta-amyloid with Na,K-ATPase as a putative regulator of the enzyme function, Scientific Reports. 6, 27738. 5. Kechko, O. I., Petrushanko, I. Y., Brower, C. S., Adzhubei, A. A., Moskalev, A. A., Piatkov, K. I., Mitkevich, V. A. & Makarov, A. A. (2019) Beta-amyloid induces apoptosis of neuronal cells by inhibition of the Arg/N-end rule pathway proteolytic activity, Aging. 11, 6134-6152. 6. Adzhubei, A. A., Sternberg, M. J. & Makarov, A. A. (2013) Polyproline-II helix in proteins: structure and function, Journal of molecular biology. 425, 2100-32. 7. Pekov, S. I., Ivanov, D. G., Bugrova, A. E., Indeykina, M. I., Zakharova, N. V., Popov, I. A., Kononikhin, A. S., Kozin, S. A., Makarov, A. A. & Nikolaev, E. N. (2019) Evaluation of MALDI-TOF/TOF Mass Spectrometry Approach for Quantitative Determination of Aspartate Residue Isomerization in the Amyloid-beta Peptide, Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30, 1325-1329. 8. Ivanov, D. G., Indeykina, M. I., Pekov, S. I., Bugrova, A. E., Kechko, O. I., Iusupov, A. E., Kononikhin, A. S., Makarov, A. A., Nikolaev, E. N. & Popov, I. A. (2019) Relative Quantitation of Beta-Amyloid Peptide Isomers with Simultaneous Isomerization of Multiple Aspartic Acid Residues by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry, J Am Soc Mass Spectrom doi.org/10.1021/jasms.9b00025.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Концепция Проекта основана на гипотезе о критической роли амилоидных матриц -нековалентных комплексов между изоформами бета-амилоида, характерными для амилоидных бляшек из тканей мозга пациентов с диагнозом болезни Альцгеймера (БА), и специфическими нейрональными белками, вовлеченными в нормальный физиологический цикл интактных молекул бета-амилоида (Aβ), - в инициировании патологической агрегации эндогенных молекул бета-амилоида при БА. Соответственно, ингибирование образования амилоидных матриц представляется перспективной стратегией в разработке терапии БА, а поиск и валидация молекулярных агентов, которые специфически связываются с аминокислотными участкам в интерфейсах матриц, является приоритетом Проекта. В 2020 году основными решаемыми задачами были: (1) установление роли отдельных изоформ бета-амилоида в образовании амилоидных матриц и выявление межмолекулярных интерфейсов амилоидных матриц в качестве потенциальных лекарственных мишеней; (2) предварительная валидация молекулярных агентов, специфически связывающихся с компонентами амилоидных матриц в области интерфейса, в качестве прототипов лекарственных кандидатов для терапии БА. Известно, что никотиновый ацетилхолиновый рецептор подтипа α4β2 (α4β2nAChR), ламинины 111 и 511, Na,K-АТФаза, прионный белок (прион, PrP) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД) взаимодействуют с Aβ при физиологических условиях и при этом ассоциированы с патологическими процессами при БА. На предыдущем этапе Проекта показано, что каждый из этих белков может участвовать в образовании амилоидных матриц. В качестве второго компонента таких матриц в 2020 году нами проверены две изоформы бета-амилоида: изомеризованная по остатку Asp7 (изоD7-Aβ) и фосфорилированная по остатку Ser8 (pS8-Аβ). Определено, что изоD7-Aβ и pS8-Аβ способны образовывать стабильные межмолекулярные комплексы, указанные ниже. Устойчивый комплекс α4β2nAchR с изоD7-Aβ и pS8-Аβ реализуется через участок 35-НАЕЕ-38 рецептора и участок 11-EVHH-14 бета-амилоидных молекул. В присутствии ионов цинка в интерфейсе участвуют His35 и Glu38 рецептора, а со стороны каждого из пептидов - Glu11 и His13. Для ламинина 111 и ламинина 511 интерфейсы взаимодействия со стороны белков включают участки 158-RADD-161 и 408-RADD-411, соответственно, а со стороны пептидов – участок 11-EVHH-14. Эти же участки (как со стороны белков, так и со стороны пептидов) образуют интерфейсы при совместной координации иона цинка. ИзоD7-Aβ и pS8-Аβ связываются с прионным белком в его октаповторной области, однако, конкретные сайты варьируют для каждой изоформы бета-амилоида. В присутствии цинка взаимодействие реализовано через координирование иона цинка остатками Asp18 и His69 приона и остатками Glu11 и His13 бета-амилоидных пептидов. Для Na,K-АТФазы выявлено, что pS8-Aβ не образовывал устойчивых комплексов с этим белком, в то же время сайт 219-EDKDK-223 β-субъединицы фермента связывался с участком 11-EVHH-14 изоD7-Aβ. Для ГАФД установлено, что что pS8-Aβ не взаимодействует с этим белком, однако, изоD7-Aβ 11-EVHH-14 образует контакты His14-Pro269 или His13-Pro269 с 268-GPLKG-272 ГАФД. Полученные результаты свидетельствуют о том, что изоD7-Aβ является более предпочтительным партнером для исследованных белков, чем pS8-Аβ. При этом обе изоформы бета-амилоида взаимодействуют с этими белками посредством своего участка 11-EVHH-14. Таким образом, в результате определения интерфейсов взаимодействия и ключевых остатков, образующих контакты амилоидных пептидов с белками-партнерами, установлены сайты связывания – новые фармакологические мишени для соединений, потенциально блокирующих эти взаимодействия, способных препятствовать образованию амилоидных матриц и снижающих риск развития БА. В качестве кандидатных молекул для ингибирования образования амилоидных матриц получены от индустриального партнера ООО «Неоген» два соединения – амиловис 1 и 3, для которых нами продемонстрирован значительный антиамилоидогенный потенциал. При тестировании на трансгенных мухах-дрозофилах D. melanogaster (используемых в качестве модели БА) показано, что изоD7-Aβ и pS8-Аβ не оказывают токсического и иммуномодулирующего действия. Эти данные поддерживают гипотезу о том, что сами по себе изоформы Aβ не играют самостоятельной роли в качестве патогенных агентов. Показано, что одновременное добавление ионов цинка и изоD7-Aβ в питательную среду приводит к значительному уменьшению средней продолжительности жизни трансгенных нематод, оверэкспрессирующих Aβ в мышечной ткани. Полученные результаты указывают на принципиальную роль нековалентных комплексов между ионом цинка и изоD7-Aβ в качестве триггера патологической агрегации эндогенных молекул Aβ. Установлено, что внутривенные инъекции пептида pS8-Aβ в дозе 3 мкг/животное приводят к существенному снижению амилоидной нагрузки в мозгу трансгенных мышей (на 37%). С использованием технологии прямого молекулярного фишинга показано, что pS8-Aβ в отличие от изоD7-Aβ взаимодействует в цинк-зависимой манере с рядом внутриклеточных белков, участвующих в регуляции транскрипции. Эти результаты указывают на то, что именно изоD7-Aβ является наиболее вероятным компонентом патогенных амилоидных матриц, а pS8-Aβ играет нормальную физиологическую роль и может служить в качестве потенциального геропротектора. Учитывая особую роль ацетилхолиновых рецепторов в патогенезе БА и полученные нами предварительные данные о том, что α4β2nAchR взаимодействует с изоформами бета-амилоида через свой сайт 35-HAEE-38, мы проверили способность синтетического аналога этого сайта выступать в качестве конкурентного ингибитора образования амилоидной матрицы с участием α4β2nAchR. Методами молекулярного моделирования и поверхностного плазмонного резонанса определено, что тетрапептид Ac-HAEE-NH2 специфически связывается с участком 11-EVHH-14 Aβ, а на рецепторах α4β2nAchR, экспрессированных в ооцитах лягушки, было показано, что тетрапептид Ac-HAEE-NH2 способен восстанавливать активность рецептора после инкубации с Aβ. Инкубация с Ac-HAEE-NH2 также снижала вызванные Aβ токи утечки, что свидетельствует о восстановлении механизмов, регулирующих ионную проницаемость рецептора. Для дальнейшей всесторонней проверки роли участка 35-HAEE-38 α4β2nAchR в формировании амилоидных матриц in vivo нами в 2020 году методом генного редактирования получена генетически модифицированная линия мышей с заменой участка HAEE на HAAA. С использованием трансгенных нематод выявлено, что тетрапептид Ac-HAEE-NH2 полностью нейтрализовал отрицательные эффекты бинарной смеси изоD7-Aβ / цинк на среднюю продолжительность жизни животных. С использованием изотопно-меченых образцов тетрапептида Ac-HAEE-NH2 определены основные фармакокинетические параметры этого пептида. Показано, что при внутривенном введении тетрапептид Ac-HAEE-NH2 проходит через гематоэнцефалический барьер. Таким образом, тетрапептид Ac-HAEE-NH2 является перспективным соединением для разрушения амилоидной матрицы Aβ / α4β2nAchR и восстановления функции холинергической системы при БА.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году основными направлениями реализации Проекта были: поиск и конструирование ингибиторов патогенного Src-зависимого каскада, индуцируемого взаимодействиями бета-амилоида (Aβ) с Na,K-АТФазой; определение молекулярного механизма ингибирования образования амилоидных матриц кандидатными соединениями, выявленными на предыдущих этапах проекта, и разработка на основе этих соединений эффективных средств предотвращения патогенных эффектов Aβ, обуславливающих развитие болезни Альцгеймера (БА); выявление роли химически модифицированных природных изоформ бета-амилоида, isoD7-Aβ и pS8-Aβ, в модулировании агрегации эндогенных молекул Aβ в животных моделях БА; формирование экспериментальных групп линии мышей с отредактированным геном CHRNA4. С использованием клеток нейробластомы человека SH-SY5Y и белковой in vitro системы установлена роль взаимодействий Aβ и Na,K-АТФазы в молекулярном механизме активирования сигнального каскада с участием Src-киназы. Показано, что связывание Aβ(1-42) с Na,K-АТФазой приводит к активации Src-зависимого каскада, который при нарушении гомеостаза Aβ(1-42) становится патогенным вследствие аберрантной активации Src-киназы. На основе моделей структур Na,K-АТФазы и пептидов Aβ(1-42), полученных на предыдущих этапах работы, была разработана методика поиска ингибиторов взаимодействия Aβ(1-42) и Na,K-АТФазы методом компьютерного моделирования и молекулярной динамики (МД). Также для разработки ингибиторов взаимодействия Src-киназы и Na,K-АТФазы было проведено моделирование интерфейса взаимодействия комплексов субъединиц α1- и α3- Na,K-АТФазы с Src-киназой с использованием докинга и МД. На основе анализа интерфейса взаимодействия Aβ(1-42) и Na,K-АТФазы и интерфейса взаимодействия Src-киназы и Na,K-АТФазы предложены ингибиторы патогенного Src-зависимого каскада, которые будут тестироваться на следующих этапах Проекта. Известно, что тетрапептид HAEE при внутривенном введении способен замедлять церебральный амилоидогенез в трансгенных мышах, использованных в качестве животной модели БА. На этапе 2021 г. для выявления молекулярного механизма антиамилоидного действия HAEE была использована комбинация in vitro, in silico и in vivo модельных систем. Методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса определено, что в водных буферных системах при физиологических значениях pH и ионной силы HAEE образует стабильные цинк-зависимые комплексы с иммобилизованными пептидами Aβ и isoD7-Aβ. С помощью спектроскопии ЯМР выяснено, что в таких комплексах ключевую роль играют металл-связывающие домены этих пептидов (Aβ(1-16) и isoD7-Aβ(1-16), соответственно). Методом МД показано, что цинк-зависимые комплексы HAEE с Aβ(1-42), isoD7-Aβ(1-42), Aβ(1-16) и isoD7-Aβ(1-16) имеют одинаковый межмолекулярный интерфейс, в котором один ион цинка совместно хелатируется боковыми группами N- и С-концевых аминокислотных остатков H и Е пептида HAEE и боковыми группами аминокислотных остатков E11 и H14 бета-амилоидных пептидов. Методом ЯМР установлено, что HAEE блокирует цинк-зависимую олигомеризацию isoD7-Aβ за счет образования стабильного комплекса isoD7-Aβ/Zn/HAEE и, таким образом, эффект HAEE по ингибированию церебрального амилоидогенеза может быть обусловлен разрушением цинк-зависимых олигомеров патогенной модифицированной формы бета-амилоида – isoD7-Aβ. Для проверки этой гипотезы были использованы трансгенные нематоды, сверхэкспрессирующие человеческий Aβ. Найдено, что присутствие isoD7-Aβ в питательной среде вызывает у нематод обширный амилоидоз, который возникает цинк-зависимым образом, и сокращает продолжительность жизни животных, а экзогенный HAEE полностью обращает вспять эти патологические эффекты isoD7-Aβ. Методом молекулярного моделирования также определено, что молекулярный механизм цинк-зависимой агрегации бета-амилоидных пептидов идет по зародышевому типу и что ингибирование роста цинк-индуцированных агрегатов Aβ должно фокусироваться на ингибировании сайта EVHH бета-амилоида. При этом такие ингибиторы должны обладать возможностью преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). На предыдущем этапе фармакокинетические исследования на трёх видах животных показали, что HAEE успешно преодолевает ГЭБ. На этапе 2021 г. с использованием методов биоинформатики и молекулярного моделирования найдено, что HAEE, подобно пептиду Angiopep 2, связывается с сайтом HHVE рецептора LRP1 на поверхности эндотелия нейроваскулярных сосудов и проходит сквозь ГЭБ по механизму рецептор-опосредованного трансцидоза. На основании полученных данных о молекулярном механизме действия пептида HAEE предложен ряд его функциональных аналогов, которые смогут выступать в качестве ингибиторов образования амилоидных матриц, но дополнительно будут обладать улучшенными фармакологическими свойствами, а именно более эффективно связываться с участком EVHH бета-амилоида, и/или быть более устойчивыми к протеолизу, и/или успешнее проходить через ГЭБ: (1) Angiopep-2; (2) тетрапептид КТЕЕ; (3) Angiopep-2 с заменой участка KTEE на HAEE (TFFYGGSRGKRNNFHAEEY-OH); (4) D-аминокислотный аналог HAEE (d-haee), (5) ретро-инверсный аналог пептида HAEE (r/i-haee). Для электрохимического анализа эффективности потенциальных ингибиторов агрегации не только интактной, но и модифицированных форм Aβ разработан комбинационный подход количественной оценки агрегационных свойств абсорбированных на матрице электрода изоформ/мутантов Aβ, различающихся по наличию в их составе электроактивных остатков Tyr, Trp, Cys, His и Met. Ранее нами было показано, что isoD7-Aβ и pS8-Aβ при внутривенном введении трансгенным мышам, используемым в качестве животной модели БА, оказывали противоположные эффекты на церебральный амилоидогенез: isoD7-Aβ его усиливал, а pS8-Aβ тормозил. В 2021 г. проведено исследование фармакокинетики пептида isoD7-Aβ(1-42) после однократного болюсного введения молодым (в возрасте 2 месяцев) трансгенным мышам линии B6C3-Tg(APP695)85Dbo(PSEN1)85Dbo. Определено, что isoD7-Aβ(1-42) преодолевает ГЭБ и накапливается в ткани мозга трансгенных мышей. По сравнению с результатами аналогичных экспериментов с использованием пептида Aβ(1-42), содержание пептида isoD7-Aβ(1-42) в исследованных препаратах было на 40-60% выше, что свидетельствует о более эффективном преодолении ГЭБа пептидом isoD7-Aβ(1-42). Найдено, что время полужизни пептида isoD7-Aβ(1-42) в крови животных составляет 12 минут, что вдвое превышает аналогичный показатель для Aβ(1 42). С использованием масс-спектрометрического анализа аутопсийных биоматериалов мозга было установлено, что содержание isoD7-Aβ в олигомерных растворимых фракциях Aβ составляет около 50% и незначительно отличается от содержания во фракции, полученной из сенильных бляшек. При этом содержание isoD7-Aβ в мозге человека значительно выше, чем в мозге трансгенных мышей линии 5XFAD (где уровень isoD7-Aβ составляет 10-25% в зависимости от возраста мыши). В 2021 г. были закончены гистохимические исследования препаратов мозга трансгенных мышей, которым на предыдущем этапе проекта проводились внутривенные инъекции пептида pS8-Aβ. Сравнительный анализ амилоидной нагрузки в мозге экспериментальных мышей свидетельствует о высокой эффективности пептида pS8-A в качестве экзогенного ингибитора церебрального амилоидогенеза в животной модели БА, при этом увеличение дозы и числа инъекций этого пептида приводит к усилению ингибиторного эффекта. С учетом выявленных на предыдущем этапе данных: (1) отсутствия токсических и иммунных реакций на внутривенное введение пептида pS8-Aβ в дозе до 30 мкг/животное, (2) положительного влияния пептида на выживаемость трансгенных животных, а также (3) частичного улучшения когнитивных функций, результаты проведенного гистохимического анализа подтверждают потенциальную роль пептида pS8-Aβ в качестве болезнь-модифицирующего средства для терапии БА. Также на этапе 2021 г. были подготовлены представительные экспериментальные группы оверэкспрессирующих человеческий Aβ трансгенных мышей, у которых в гене CHRNA4, кодирующем субъединицу α4 никотинового ацетилхолинового рецептора подтипа α4β2, вместо участка HAEE, отвечающего за специфическое связывание с участком EVHH Aβ, вставлен фрагмент HAAA, исключающий образование специфических нековалентных комплексов этого рецептора с молекулами Aβ. Подготовленные в 2021 г. животные будут использоваться на следующем этапе выполнения Проекта для выявления in vivo роли комплекса isoD7-Aβ(1-42) и никотиновового ацетилхолинового рецептора в качестве амилоидной матрицы при развитии БА.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Известно, что в периферической кровеносной системе различные изоформы Аβ взаимодействуют с белками крови, преимущественно с APOE4, α2-макроглобиулином и альбумином, и могут являться маркерами ранних стадий болезни Альцгеймера (Schindler, Bollinger et al. 2019). Ионы цинка и ряд изоформ Аβ играют критическую роль в развитии болезни Альцгеймера (Козин 2023, Супрун, Радько et al. 2023), поэтому в настоящем Проекте методами компьютерного моделирования были впервые получены данные о молекулярных механизмах цинк-зависимых взаимодействий между тремя изоформами Аβ (нативный Аβ42, изомеризованный по аминокислотному остатку Asp7 бета-амилоид, isoD7-Aβ42, и фосфорилированный по остатку Ser8, фосфоS8-Aβ42) и тремя транспортными белками крови (APOE4, α2-макроглобиулин, альбумин). Для каждого белка методом молекулярной динамики (МД) была получена равновесная конформация, а далее методом глобального белок-белкового докинга на серверах ATTRACT, LZerD, PatchDock, ZDock , Hdock и GrammX с последующим уточнением результатов таргетированным докингом и анализом на разработанном нами метасервере QASDOM (Anashkina, Kravatsky et al. 2018) были получены интерфейсы взаимодействия молекул. Установлено, что все исследуемые изоформы Aβ в отсутствии ионов цинка образуют стабильные комплексы с альбумином, АРОЕ4 и α2-макроглобулином, при этом структурно локализованный интерфейс взаимодействия наблюдался только у АРОЕ4. Однако наличие иона цинка существенно увеличивало количество водородных связей альбумина с изоформами Aβ, что подтверждает роль альбумина как основного и наиболее важного переносчика Aβ в крови. Полученные результаты также впервые показали, что в присутствии ионов цинка комплексы альбумина с изоформами Aβ становятся существенно более стабильными, и, таким образом, ионы цинка выступают как модуляторы транспорта Aβ в организме. Определены интерфейсы взаимодействия изоформ Aβ с двумя важными для патогенеза болезни Альцгеймера белками: никотиновым ацетилхолиновым рецептором подтипа α4β2 (α4β2nAChR) и Na,K-АТФазой (Barykin, Garifulina et al. 2020, Adzhubei, Tolstova et al. 2022) (Petrushanko, Tverskoi et al. 2022), а также было показано, что тетрапептид Ac-His-Ala-Glu-Glu-NH2 (НАЕЕ) эффективно блокирует эти взаимодействия. Используя НАЕЕ в качестве прототипа, мы подобрали следующие потенциальные ингибиторы образования зародышей агрегации Aβ («амилоидных матриц»): (1) олигопептид Ac-TFFYGGSRGKRNNFKTEEY-NH2 (Angiopep-2); (2) Angiopep-2 c заменой KTEE на HAEE («AngiopepHAEE»); (3) пептид ЕЕАН; (4) пептид КТЕЕ; (5) пептид MHAEEPGP. Методы компьютерного моделирования были использованы при тестировании эффективности этих соединений для ингибирования образования амилоидных матриц с участием α4β2nAChR и Na,K-АТФазы. Полученные результаты указывают на пептид AngiopepHAEE, как самый эффективный из исследованных ингибиторов: он показал наиболее обширную область связывания с большим количеством водородных связей как с α4β2nAChR так и с Na,K-АТФазой в присутствии и в отсутствие ионов цинка. В ходе выполнения Проекта было установлено, что агрегация эндогенных молекул Aβ42 в трансгенных нематодах C. elegans инициируется нековалентным комплексом isoD7-Aβ42 с ионом цинка (Zn2+/isoD7-Aβ42) по молекулярному механизму цинк-зависимой олигомеризации бета-амилоида (Mitkevich, Barykin et al. 2022, Козин, Барыкин et al. 2022). Также было показано, что как эналаприлат (Козин, Барыкин et al. 2022), так и пептид HAEE (Mitkevich, Barykin et al. 2022), которые специфически связываются с комплексом Zn2+/ isoD7-Aβ42 посредством совместного хелатирования иона цинка на межмолекулярном интерфейсе, подавляют способность Zn2+/isoD7-Aβ42 выступать в роли амилоидной матрицы эндогенного Aβ42. Из группы кандидатных молекул, антиамилоидные свойства которых были протестированы in silico и in vitro в качестве наиболее перспективных ингибиторов образования амилоидных матриц были выбраны: (1) D-аминокислотный аналог тетрапептида HAEE («d-haee»); (2) AngiopepHAEE. В качестве интегрального критерия эффективности антиамилоидного действия препаратов d-haee или AngiopepHAEE использовался показатель средней продолжительности жизни нематод в присутствии соответствующих препаратов в питательной среде, на которой содержались животные. По результатам тестирования наивысшую эффективность в качестве ингибитора образования амилоидных матриц показал AngiopepHAEE. Добавление этого пептида в питательную среду нематод полностью нейтрализовало патогенные эффекты Zn2+/isoD7-Aβ42. По результатам работы подана заявка на патент. На ранних стадиях болезни Альцгеймера происходит повреждение рецепторов α4β2nAChR, с которыми Aβ образует специфические комплексы посредством участков 11-EVHH-14 и 35-HAEE-38 аминокислотных последовательностей бета-амилоида и субъединицы α4 рецептора α4β2nAChR, соответственно (Lawrence, Tong et al. 2014, Barykin, Garifulina et al. 2020). Рецепторы α4β2nAChR являются наиболее широко распространенными в коре головного мозга, и утрата когнитивных функций пациентами по мере развития болезни Альцгеймера сопровождается существенным сокращением доступности этих рецепторов (Sabri, Meyer et al. 2018). Косвенные данные указывают на то, что зародышами агрегации эндогенных молекул Aβ являются нековалентные комплексы isoD7-Aβ42 с рецепторами α4β2nAChR (Barykin, Garifulina et al. 2020). Чтобы получить прямые экспериментальные доказательства роли таких комплексов в развитии болезни Альцгеймера, в настоящем Проекте методами генного редактирования (CRISPR/Cas) были получены мыши, у которых в аминокислотной последовательности субъединицы α4 рецептора α4β2nAChR участок 35-HAEE-38 заменен на участок 35-HAAA-38, а затем скрещиванием таких животных с редактированным геномом (GE(HAEE>HAAA)) и трансгенных мышей линии Tg(APPswe,PSEN1dE9), оверпродуцирующих человеческий Аβ, были выведены животные с объединённым генотипом Tg(APPswe,PSEN1dE9)/GE(HAEE>HAAA), которые одновременно оверпродуцируют человеческий Аβ и обладают мутантными рецепторами HAEE>HAAA-α4β2nAChR с сайтом HAAA вместо HAEE. Постмортальный анализ тяжести амилоидной нагрузки показали, что животные Tg(APPswe,PSEN1dE9)/GE(HAEE>HAAA) по сравнению с контрольными мышами линии линии Tg(APPswe,PSEN1dE9) содержат существенно меньше амилоидных бляшек в головном мозгу. Полученные результаты впервые на животной модели болезни Альцгеймера показали, что именно интерфейс между 11-EVHH-14 Аβ и 35-HAEE-38 α4β2nAChR является критическим для развития церебрального амилоидогенеза и, таким образом, данный интерфейс представляет собой наиболее перспективную лекарственную мишень для разработки патогенетической терапии болезни Альцгеймера. Адреса в сети Интернет, посвященные результатам проекта: https://www.rscf.ru/news/release/dvoynaya-igra-khimiki-obyasnili- neodnoznachnuyu-rol-tsinka-v-razvitii-bolezni-altsgeymera/; https://colab.ws/news/160; https://spid.center/ru/posts/7414; https://polit.ru/news/2022/03/02/ps_zn/