КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 16-16-10035

НазваниеРеорганизация органелл в ходе дифференцировки растительной клетки азотфиксирующего клубенька для хостинга симбиосом – временных клеточных органелл микробного происхождения

РуководительЦыганов Виктор Евгеньевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии", г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ

2019 г. - 2020 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые словамикробно-растительные системы, бобово-ризобиальный симбиоз, бобовые растения, симбиотический клубенек, клеточная дифференцировка, клеточные органеллы, симбиосомы, конфокальная микроскопия, электронная микроскопия, лазерная микродиссекция, транскриптомный анализ, Pisum sativum, Medicago truncatula

Код ГРНТИ68.03.03 68.03.07

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы –выявление молекулярно-генетических и клеточных механизмов развития симбиотических клубеньков Бобовых. Конкретной фундаментальной задачей проекта является выявление молекулярно-генетических и клеточных механизмов дифференцировки растительной клетки во время хостинга органелло-подобных азотфиксирующих симбиосом. В работе будут использованы методы иммуноцитохимического анализа, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и электронной микроскопии, методы лазерной микродиссекции, анализа экспрессии генов, а также адекватные генетические модели – мутанты P. sativum и M. truncatula, блокированные на различных стадиях развития симбиотического клубенька. Важной задачей проекта является продолжение и углубление исследований растительно-микробного интерфейса. С использованием специфических моноклональных антител, характеризующихся повышенной специфичностью к деметилированному гомогалактуронану или к димерам пектиновых цепей, связанных ионами кальция, будет подтверждена роль гомогалактуронана в повышении ригидности стенок инфекционных нитей, в том числе при развитии неэффективных клубеньков. Использование широкого набора антител позволит изучить роль рамногалактуронана I не только в клубеньках P. sativum, но и M. truncatula. Впервые будет проведен анализ распределения в клубеньках P. sativum и M. truncatula исходных и мутантных линий с нарушениями развития инфекционных нитей рамногалактуронана II, что позволит выявить функцию этого пектина в развитии инфекционных нитей. Планируется изучение роли минорных фракций пектинов в клубеньках P. sativum и M. truncatula (ксилогалактуронан). В результате впервые для симбиотических клубеньков будет выявлена полная картина распределения как мажорных, так и минорных пектинов в клубеньках бобовых растений. Будет изучен широкий спектр арабиногалактановых белков и арабиногалактанпротеин-экстезинов с использованием большого набора моноклональных антител в клубеньках P. sativum и M. truncatula исходных и мутантных линий. Это позволит впервые описать роль арабиногалактановых белков и арабиногалактанпротеин-экстезинов в дифференцировке симбиосом и развитии инфекционных нитей в клубеньках M. truncatula и значительно расширить представления об их функциях в клубеньках P. sativum. Важной задачей проекта является выявление специфической роли каждого типа цитоскелета (микротрубочек и актиновых микрофиламентов) в распределении симбиосом на различных этапах дифференцировки инфицированной клетки симбиотического клубенька. Для этого будут использованы ингибиторы полимеризации цитоскелета: латрункулин B для актина и оризалин для тубулина. В ходе выполнения проекта впервые для изучения тонких механизмов движения ядра во время дифференцировки инфицированных клеток клубеньков P. sativum и M. truncatula будет исследована роль комплекса LINC (linker of nucleoskeleton and cytoskeleton), отвечающего за взаимодействие ядра с элементами цитоскелета. С помощью лазерной микродиссекции будет проведен сравнительный анализ профилей экспрессии генов, кодирующих α и β тубулин, в различных типах клеток клубеньков исходной линии P. sativum SGE и мутантов, характеризующихся повышенной и пониженной степенью развития тубулинового цитоскелета. Таким образом, выполнение проекта будет способствовать выявлению молекулярно-генетических и клеточных механизмов обретения растительной клетки симбиотического состояния и способности к фиксации азота. Расшифровка таких механизмов является необходимым условием для создания высокоэффективных растительно-микробных систем и их полноценного применения в адаптивном сельском хозяйстве. В целом, предлагаемый проект находится в русле современных направлений исследований мировой науки и сфокусирован на малоизученных вопросах дифференцировки растительной клетки при заселении ее органелло-подобными симбиосомами. Предлагаемая для реализации проекта комбинация генетического, цитологического и молекулярно-биологического подходов гарантируют успешное его выполнение.

Ожидаемые результаты
Предлагаемый проект посвящен сравнительным исследованиям клеточной организации клубеньков двух бобовых культур. Одна из них – Medicago truncatula является активно изучаемым модельным бобовым растением, а вторая – Pisum sativum –ценнейшая зернобобовая культура в России и Европе. Понимание клеточной организации клубеньков бобовых культур является одним из необходимых условий создания высокоэффективных растительно-микробных систем для адаптивного сельского хозяйства. Будет проведен анализ изменений в эпитопном составе арабиногалактановых белков и арабиногалактанпротеин-экстензинов в клетках клубеньков исходных и мутантных линий P. sativum и M. truncatula, блокированных на различных стадиях клеточной дифференцировки и роста инфекционной нити, с помощью иммуноцитохимического анализа и использования конфокальной и электронной микроскопии. Таким образом, будет выявлено значение различных арабиногалактановых белков и арабиногалактанпротеин-экстензинов для дифференцировки симбиосом и развития инфекционных нитей. Будет проведен анализ изменений в эпитопном составе пектиновых компонентов (гомогалактуронана, рамногалактуронанов I и II и ксилогалактуронана) в клетках клубеньков исходных и мутантных линий P. sativum и M. truncatula, блокированных на различных стадиях клеточной дифференцировки и роста инфекционной нити, с помощью иммуноцитохимического анализа и использования конфокальной и электронной микроскопии. Таким образом, будет выявлено значение различных пектиновых компонентов для развития инфекционных нитей. С использованием ингибиторов полимеризации цитоскелета (латрункулина В для актиновых микрофиламентов и оризалина для микротрубочек) будет проанализировано влияние деполимеризации элементов цитоскелета на расположение симбиосом в инфицированных клетках в различных зонах клубеньков линий дикого типа SGE для P. sativum и А17 для M. truncatula. В результате выполненных исследований впервые будет выявлена специфическая роль актина и тубулина в распределении симбиосом в инфицированных клетках клубеньков. Будет проведен анализ колокализации белков SUN1, SUN2, актиновых микрофиламентов и микротрубочек в инфицированных клетках на различных стадиях дифференцировки клубеньков P. sativum и M. truncatula. Анализ колокализации будет проведен как с использованием конфокальной микроскопии, так и с помощью электронной микроскопии. Исследование будет проведено не только для инфицированных клеток, находящихся на различных стадиях дифференцировки, в клубеньках исходных линий, но и для мутантов в ортологичных генах P. sativum и M. truncatula sym33/ipd3 и sym40/efd, для которых была выявлена тесная ассоциация ядра с инфекционными структурами (инфекционными нитями и каплями, соответственно). Это позволит выявить роль комплекса LINC (linker of nucleoskeleton and cytoskeleton) в движении ядра в ходе дифференцировки инфицированной клетки в клубеньках P. sativum и M. truncatula. Будет проведен сравнительный анализ уровней экспрессии генов α и β тубулина в инфицированных и неинфицированных клетках клубеньков исходной линии гороха SGE, клетках с гипертрофированными инфекционными каплями и без таковых у аллельных мутантов SGEFix--1 (sym40), SGEFix--6 (sym40), клетках с запертыми инфекционными нитями у аллельных мутантов SGEFix--2 (sym33-3), SGEFix--5 (sym33-2). Таким образом, выполнение проекта будет способствовать решению ключевой проблемы – изучению дифференцировки инфицированной клетки клубенька, подготавливающей ее к размещению большого числа органелло-подобных симбиосом. Полученные в ходе реализации проекта результаты будут служить теоретической базой для разработки новых высокоэффективных растительно-микробных систем, в которых будут обеспечены оптимальные условия для эффективного функционирования симбиосом в инфицированных клетках. Использование таких систем является необходимым условием активного развития в Российской Федерации адаптивного земледелия, направленного на производство полноценной, экологически чистой и оздоровляющей сельскохозяйственной продукции. Кроме того, проект будет способствовать выявлению общих механизмов развития хронических инфекций, в том числе приводящих к опасным для человека заболеваниям (например, туберкулез). Понимание таких механизмов может стимулировать разработку новых методов лечения хронических инфекций. Полученные результаты будут также использованы при подготовке лекционных курсов, читаемых членами коллектива ФГБНУ ВНИИСХМ в Санкт-Петербургском государственном университете. В ходе выполнения проекта будет происходить обучение аспирантов и молодых ученых ФГБНУ ВНИИСХМ и студентов Санкт-Петербургского государственного университета самым современным методам исследований на уникальной приборной базе, имеющейся в распоряжении ФГБНУ ВНИИСХМ.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В клубеньках M. truncatula в инфицированных клетках из ранней зоны инфекции деполимеризация как актиновых микрофиламентов, так и микротрубочек приводило к нарушению равномерного распределения немногочисленных симбиосом по периферии клетки. Наблюдалась кластеризация симбиосом в отдельных участках клетки. В инфицированных клетках из поздней зоны инфекции деполимеризация актиновых микрофиламентов также способствовала кластеризации симбиосом. В то же время разборка микротрубочек вела к свободному распределению симбиосом по объему цитоплазмы. В зоне азотфиксации разборка микротрубочек также вызывала формирование нерегулярного паттерна симбиосом. В то же время деполимеризация актиновых микрофиламентов приводила к меньшим нарушениям в паттерне симбиосом, по сравнению с разборкой микротрубочек. Таким образом, вероятно, в клубеньках M. truncatula инфицированных клетках в зоне инфекции как актиновый, так и тубулиновый цитоскелет вовлечены в распределение высвобождающихся из инфекционных нитей ризобий, которые при этом дифференцируются в бактероиды и формируют симбиосомы. В то же время в зоне азотфиксации для поддержания регулярного паттерна симбиосом более важной является сеть эндоплазматических микротрубочек. В клубеньках гороха в инфицированных клетках в зоне инфекции при обработке ингибиторами полимеризации микротрубочек и актиновых микрофиламентов формировались аномальные паттерны симбиосом, сходные с таковыми у M. truncatula. В то же время в инфицированных клетках из зоны азотфиксации действие ингибиторов было трудно оценить, т.к. для клубеньков гороха свойственен нерегулярный паттерн распределения симбиосом [Kitaeva et al., 2016. New Phytol. 210: 168–183]. В результате иммуноцитохимического анализа различных эпитопов арабиногалактановых белков и арабиногалактанпротеин-экстензинов было обнаружено, что в тканях симбиотических клубеньков как P. sativum, так и M. truncatula JIM13-узнаваемые эпитопы локализовались в эндодерме, составляющей «кислородный барьер» клубеньков. Было обнаружено наличие эпитопа экстензина, распознаваемого антителом JIM11, в матриксе инфекционных нитей и капель и в матриксе межклеточного пространства клубеньков гороха и M. truncatula. Также LM6-узнаваемый эпитоп появляется в симбиосомах как в клубеньках гороха, так и в клубеньках M. truncatula, причем его наличие связано с ювенильными бактероидами из зоны инфекции и ранней азотфиксации в случае линий дикого типа обоих видов, так и с недифференцированными или аномальными бактероидами у мутантов обоих видов. Была проведена лазерная микродиссекция различных типов клеток в клубеньках гороха дикого типа линии SGE и мутантных линий, характеризующихся наличием блокированных инфекционных нитей (SGEFix−-2 (sym33-3), SGEFix−-5 (sym33-2)) и гипертрофированных инфекционных капель (SGEFix−-1 (sym40-1), SGEFix−-6 (sym40-2)). В сети Интернет имеется информационный ресурс, посвященный проекту: https://www.researchgate.net/project/Reorganization-of-organelles-during-plant-cell-differentiation-in-nitrogen-fixing-nodule-for-hosting-of-symbiosomes

Публикации

1. Сафронова В., Белимов А., Сазанова А., Чирак Е., Кузнецова И., Андронов Е., Пинаев А., Цыганова А., Селиверстова Е., Китаева А., Цыганов В., Тихонович И. Two broad host range rhizobial strains isolated from relict legumes have various complementary effects on symbiotic parameters of co-inoculated plants Frontiers in Microbiology, 10, 514 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00514

2. Цыганова А.В., Селивёрстова Е.В., Бревин Н.Дж., Цыганов В.Е. Comparative analysis of remodelling of the plant–microbe interface in Pisum sativum and Medicago truncatula symbiotic nodules Protoplasma, Vol. 256, N 4. P. 983-996. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1007/s00709-019-01355-5

3. Цыганова А.В., Селивёрстова Е.В., Бревин Н.Дж., Цыганов В.Е. Bacterial release is accompanied by ectopic accumulation of cell wall material around the vacuole in nodules of Pisum sativum sym33-3 allele encoding transcription factor PsCYCLOPS/PsIPD3 Protoplasma, Vol. 256, N 5. P. 1449-1453. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1007/s00709-019-01383-1

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Была проведена колокализация актиновых микрофиламентов, микротрубочек и белков SUN1, SUN2, являющихся компонентами комплекса LINC. Однако, низкая специфичность использованных антител не позволила сделать детальных выводов. Тем не менее можно предположить, что наблюдаемое специфичное связывание антител к SUN 1,2 с белками ядра в азотфиксирующих клетках клубеньков P. sativum указывает на роль белков SUN1, 2 в позиционировании ядра в центре этих клеток рядом с центральной вакуолью. После появления высокоспецифичных антител к SUN 1,2, которые в настоящее время проходят тестирование, станет возможным развить данное направление исследований. При иммуноцитохимическом исследовании различных пектинов в симбиотических клубеньках P. sativum и M. truncatula была продемонстрирована видоспецифичность локализации и распределения низко метилэтерифицированного гомогалактуронана, меченого антителом LM19, которая заключалась в накоплении этого пектина в клеточных стенках у P. sativum, но не у M. truncatula. Связанный с Ca2+ гомогалактуронан, наличие которого свидетельствует об увеличении ригидности клеточных стенок, также имеет видоспецифичный паттерн локализации. Так, у P. sativum этот пектин, оставаясь в стенках инфекционных нитей, практически исчезал из клеточных стенок инфицированных клеток в зоне азотфиксации, а у M. truncatula наоборот происходило его накопление в клеточных стенках зрелых инфицированных клеток. Мутанты также демонстрировали изменение эпитопного состава гомогалактуронана. У мутанта M. truncatula TR3 (ipd3) высоко метилэтерифицированный гомогалактуронан практически отсутствовал в клеточных стенках и стенках инфекционных нитей. Был впервые проведен анализ локализации рамногалактуронана I с помощью антител к его полисахаридной основе, что позволило продемонстрировать его наличие у обоих изученных видов, но паттерн его распределения несколько различается. Кроме того, нами было впервые изучено распределение другого замещенного пектина, ксилогалактуронана. Было продемонстрировано его практически полное отсутствие в клубеньках P. sativum и M. truncatula, но его количество заметно увеличивалось у мутантов M. truncatula efd и TR3 (ipd3). Впервые было изучено распределение фукозилового ксилоглюкана (гемицеллюлозы) в клубеньках P. sativum и M. truncatula и продемонстрировано, что данный ксилоглюкан распространен в клеточных стенках симбиотических клубеньков, особенно в клубеньках M. truncatula, где он накапливается не только в клеточных стенках, но и в вакуолях инфицированных клеток. В настоящем исследовании нами было впервые изучено распределение ферулового полисахарида, предшественника фенольных соединений, с помощью антитела LM12 и показано крайне малое количество эпитопа этого полисахарида в клеточных стенках и стенках инфекционных нитей у обоих изученных видов. Была проведена лазерная микродиссекция инфицированных и неинфицированных клеток клубеньков исходной линии гороха SGE, клеток с гипертрофированными инфекционными каплями и без таковых у мутанта SGEFix--1 (sym40). Полученный исходный материал был использован для выделения тотальной РНК, получения РНК после амплификации (аРНК) и синтеза кДНК. Был проведен сравнительный анализ экспрессии генов синтеза мономеров тубулина в различных типах клеток клубеньков исходной и мутантной линии. Для гена PsgTUB1, кодирующего бета-тубулин, в клубеньках дикого типа максимум его экспрессии был выявлен в зоне инфекции, что, вероятно, связано с активной дифференцировкой клеток, сопровождаемой увеличением их размера, для размещения многочисленных симбиосом и активным формированием сети эндоплазматических микротрубочек, ассоциированной с инфекционными нитями, инфекционными каплями и симбиосомами В то же время отсутствие максимума уровня экспрессии гена PsTubA1, кодирующего альфа-тубулин, в зоне инфекции может быть связано с активностью других ортологичных генов, которые будут исследованы в ходе проведения дальнейших исследований. Более низкий уровень экспрессии обоих генов в клубеньках мутанта SGEFix--1 (sym40), вероятно связан с тем, что в инфицированных клетках этого мутанта основной объем клетки занимает гипертрофированная инфекционная капля, и, количество симбиосом (с которыми связано основное количество формирующихся эндоплазматических микротрубочек) ниже, чем в инфицированных клетках дикого типа. Кроме того, ранняя активация деградации симбиотических структур в мутантных клубеньках также может приводить к снижению уровня экспрессии генов тубулина. Было показано негативное влияние фунгицида ТМТД на ультраструктуру симбиотических клубеньков P. sativum. Оно проявлялось в изменении клеточных стенок в виде истончения, деформации и набухания, стенок инфекционных нитей в виде утолщения, в бактероидах накапливались гранулы полигидроксибутирата, миелиноподобные структуры и крупные сферические включения неизвестной природы, а также происходило слияние симбиосом с деградацией бактероидов и последующим их лизисом с образованием «теней» бактероидов. Проведенная иммунолокализация транспортных форм цитокининов (транс-зеатин рибозида или N6-изопентениладенозина) указывает на возможную положительную регуляцию дифференцировки бактероидов цитокининами в недетерминированных клубеньках. С другой стороны, уровень дифференцировки бактероидов может влиять на накопление цитокининов в инфицированных клетках клубеньков. Таким образом, будущие эксперименты должны изучить взаимосвязь между обоими процессами во время развития клубеньков.

Публикации

1. Горшков А.П., Цыганова А.В., Воробьев М.Г., Цыганов В.Е. The fungicide tetramethylthiuram disulfide negatively affects plant cell walls, infection thread walls, and symbiosomes in pea (Pisum sativum L.) symbiotic nodules Plants, 9(11), article 1488. (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/plants9111488

2. Долгих Е.А., Кусакин П.Г., Китаева А.Б., Цыганова А.В., Кириенко А.Н., Леппянен И.В., Долгих А.В., Ильина Е.Л., Демченко К.Н., Тихонович И.А., Цыганов В.Е. Mutational analysis indicates that abnormalities in rhizobial infection and subsequent plant cell and bacteroid differentiation in pea (Pisum sativum) nodules coincide with abnormal cytokinin responses and localization Annals of Botany, 125(6): 905-923 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1093/aob/mcaa022

3. - Показан вред фунгицида ТМТД для сельского хозяйства Indicator.ru, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
В настоящее время практическое использование результатов не просматривается. Тем не менее, получены данные о вреде высоких концентраций фунгицида ТМТД в субстрате на структуру клубеньков (клеточные стенки, стенки инфекционных нитей и симбиосомы). Эти данные указывают на нежелательное использование ТМТД в сельском хозяйстве Российской Федерации. Они были представлены широкой общественности (https://indicator.ru/agriculture/pokazan-vred-fungicida-tmtd-dlya-selskogo-khozyaistva-04-12-2020-837857.htm). Запрещение использования ТМТД в России, по примеру Европейского союза, должно способствовать развитию экологически ориентированного сельского хозяйства в Российской Федерации.