Аннотация результатов, полученных в 2019 году
СОКРАЩЕНИЯ. ПТП-противотуберкулезные препараты, МИК – минимальная ингибирующая концентрация, МЛУ-множественная лекарственная устойчивость, ШЛУ – широкая лекарственная устойчивость, SNP-single nucleotide polymorphism (ОНП-однонуклеотидный полиморфизм), NGS-next generation sequencing, WGS-whole genome sequencing. Проведен химический синтез целевых соединений соединений–кандидатов с возможной противотуберкулезной активностью для их дальнейшего тестирования на штаммах микобактерий туберкулеза. Набор из 4 клеточных линий: HEP-G2, HaCaT, HEK293 и CCL-1 использовали для изучения цитотоксичности и метаболизма тестируемых соединений. Колориметрический тест МТТ применяли для определения средних ингибирующих концентраций 50% (IC50). Тест КОЕ основан на способности клеток образовывать колонии в полутвердой среде, обогащенной факторами роста, и показывает длительный антипролиферативный эффект соединений, если он обнаружен. Пять тестируемых соединений оценивали на цитотоксичность in vitro в отношении нормальной линии эмбриональных клеток почек человека HEK293. Клетки обрабатывали 10 концентрациями соединений в диапазоне от 0,2 до 100 мкМ в двухкратных серийных разведениях и инкубировали в течение 24, 48 и 72 часов. Полученные результаты показали, что ни одно из соединений не ингибировало пролиферацию клеток после 72-часового инкубирования с концентрациями до 12,5 мкМ, в результате чего выживаемость клеток в обработанных образцах существенно не отличалась от необработанного контроля. или процент фракции выживших клеток был выше 70% (ISO10993-5 / 2009). Скрининг противотуберкулезной активности химических соединений на лабораторном штамме H37Rv и панели клинических изолятов. Определение МИК проводили в ресазуриновом тесте в микропланшетах (REMA – resazurin microdilution assay). Проведен скрининг исследуемых соединений (DM-62, DM-63, DM-136, DM-144B, DM-146B, DN-046, DL-172, DL-173, DL-176, CB-022A, CB-044, DO-062, DO-066, DM-136) с помощью музейного штамма M. tuberculosis H37Rv (штамм получен из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава РФ - TBC # 1/47). Наиболее эффективные (по результатам тестирования на лабораторном штамме) вещества были проверены на панели 30 клинических изолятов разных генотипов и с разными профилями лекарственной устойчивости. Самое эффективное соединение - CB-022A, МИК 3,1 мкг/мл. – новое соединение, которое не было запланировано изначально, но было разработано в ходе реализации проекта. Данные находятся в процессе статистической обработки. Предварительные результаты показывают в каком направлении нужно менять структуру целевых соединений для усиления их противотуберкулезной активности. Выявление штаммов устойчивых к новому противотуберкулезному препарату бедаквилину (для обновления панели изолятов для тестирования новых соединений) Новые лекарства, такие как бедаквилин, требуют длительного, до 6 месяцев, лечения, в то время как такое длительное лечение (=селективное давление антибиотика) дает микобактериям больше времени для развития резистентности. В то же время новые соединения являются дорогостоящими и не используются регулярно, даже в Российской Федерации. Бедаквилин - новый противотуберкулезный препарат и первый препарат действующий на микобактериальную АТФ-синтазу. Замены в гене atpE предотвращают взаимодействие препарата с его мишенью, АТФ-синтазой. Мутации в локусе репрессорного гена mmpR (Rv0678) приводят к повышенной экспрессии генов mmpL5 и mmpS5, обеспечивая эффлюкс бедаквилина. Другими генами, предположительно связанными с устойчивостью к бедаквилину, являются pepQ, atpC и Rv1979c. Калининградская область характеризуется высокой заболеваемостью туберкулезом (38,8 на 100 000) и долей МЛУ среди впервые диагностированных больных туберкулезом (30,5%). Пациенты были госпитализированы в туберкулезную больницу при областном противотуберкулезном диспансере. Изоляты M. tuberculosis были выделены из мокроты больных с интервалами 1-3 месяца, и определение устойчивости для антибиотиков 1-го и 2-го ряда проводили с использованием метода абсолютных концентраций или Bactec MGIT 960. Полногеномное секвенирование проводили на платформе MiSeq и NextSeq (Illumina). Файлы fastq были проанализированы с использованием программы Geneious 9 (Biomatters, Новая Зеландия), PhyReSE https://bioinf.fz-borstel.de/mchips/phyresse/ и PhyTB http://pathogenseq.lshtm.ac.uk/phytblive/index. Белковые структуры были предсказаны с использованием веб-портала Phyre2 и визуализированы с помощью инструмента UCSF Chimera. Всего было зарегистрировано десять пациентов и от трех до шести изолятов было получено для каждого пациента. Первые выделенные (до применения бедаквилина) изоляты были ШЛУ (7) и пред-ШЛУ (3). Генотипирование показало, что все изоляты принадлежали к генотипу Beijing, что отличается от структуры популяции Mtb в Калининграде в целом, в которой Beijing доминирует (60%) но и генотипы не-Beijing составляют 40% популяции (Вязовая и др., 2017). Мутации в Rv0678 (mmpR) были наиболее частыми, и были обнаружены различные виды мутаций (несинонимичные замены, сдвиг рамки, инделы затрагивающие 2-3 кодона), а в некоторых случаях разные мутации сосуществовали и во всех случаях имела место гетерорезистентность т.е микс дикого и мутантного аллелей по одной и той же позиции. Только у одного пациента в процессе лечения возникла мутация в гене atpE. Таким образом, мутации в Rv0678 представляют основной механизм устойчивости к BDQ в российских условиях; развитие резистентности во время лечения не редкость, поскольку мутации устойчивости к BDQ появились у 4/10 пациентов; возможно развитие резистентности через 2-3 месяца после прекращения лечения. Штаммы, генотипически устойчивые к бедаквилину, будут включены в панель изолятов для тестирования новых соединений, которые (будут) разработаны в данном проекте. Молекулярная характеристика M. tuberculosis в Коми для выявления актуальных резистентных генотипов Согласно официальным данным в 2017 г. в Республике Коми было выявлено 313 больных туберкулезом легких, из них 174 бактериовыделителя. Критериями включения в исследование являлись:1) впервые выявленный туберкулез легких, 2) возраст старше 18 лет, 3) постоянное проживание в Республике Коми, 4) наличие культуры M. tuberculosis. Таким образом в исследование вошло 130 изолятов M. tuberculosis от 96 (73,8%) мужчин и 34 (26,2%) женщин, проживающих в 8 городах республиканского значения с подчиненными им территориями и 12 районов. Оценка лекарственной чувствительности M. tuberculosis показала, что 64 (49,2%) из 130 изолятов, сохранили чувствительность к ПТП. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) выявлена у 40 (30,8%) изолятов (включая 2 из 11 штаммов, выделенных от ВИЧ-инфицированных), из них 8 ШЛУ. Анализ мутаций в генах, ассоциированных с устойчивостью M. tuberculosis к рифампицину и изониазиду, проводили для 32 из 40 МЛУ/ ШЛУ (14 - Beijing B0/W148-кластер, 11 - Beijing 94-32-кластер, 3 – других Beijing и 4 - non-Beijing) штаммов M. tuberculosis. Генотипическая резистентность к рифампицину и изониазиду была обусловлена заменами rpoВ Ser531->Leu и katG Ser315->Thr1 у всех изученных МЛУ штаммов, за исключением трех изолятов Beijing 94-32-кластера. В одном случае выявлена мутация rpoВ Ser531->Trp, в другом - rpoВ Asp516->Tyr. У третьего штамма устойчивость к изониазиду была связана с мутациями в двух генах katG Ser315->Thr1 и inhA C (-15) T. Выявленные мутации, ассоциированные с мультирезистентностью совпали с фенотипическими результатами. Генотипирование выявило принадлежность 73 (56,2%) изолятов к генотипу Beijing. В целом превалирование штаммов Beijing в структуре генотипов согласуется с данными, полученными в разных регионах РФ, и в частности 44,4 % в Псковской области, 55,1 % в Республике Карелия, 63,0% в Калининградской области [ Mokrousov et al. 2012; Вязовая и др., 2012; Mokrousov et al. 2015; Вязовая и др., 2016; Вязовая и др., 2017]. К двум основным кластерам генотипа Beijing современной сублинии - В0/W148 и 94-32 были отнесены 24 (18,5%) и 44 (33,8%) штаммов M. tuberculosis. При этом доли МЛУ/ШЛУ штаммов данных кластеров Beijing различались, составляя 79,2% и 29,5% соответственно (р = 0,0031, OR = 0,16 [0,05; 0,54]). Сполиготипирование 57 штаммов non-Beijing M. tuberculosis позволило выделить 26 сполиготипов (SIT), пяти генотипов - Т, LAM, Ural, Нaarlem, X. У семи штаммов принадлежность к генетическому семейству не установлена (Unknown - неклассифицированный). SIT42/LAM (n=6) и новый сполиготип семейства Ural (n=4), ранее не зарегистрированный в SITVIT2. Самая многочисленная среди non-Beijing группа T (14,6%) представлена в основном ЛЧ изолятами (84,2%). Наиболее распространенными сполиготипами были SIT52 (n=5) и SIT53 (n=9), при этом один штамм SIT53 обладал ШЛУ. В целом доля МЛУ штаммов non-Beijing - других генетических групп (суммарно) в Республике Коми составила 8,8% (табл.1), что существенно ниже аналогичных показателей в Калининградской области (25,9% в 2015 г.) и в Республике Карелия (19,4% в 2013-2014 гг.). Таким образом, популяция M. tuberculosis в Республике Коми генетически неоднородна и представлена штаммами глобально распространенных генетических групп - T (14,6%), LAM (12,3%), Ural (6,9%) и Haarlem (3,8%), среди которых доминирует Beijing (56,2%), доля которого за 10 лет возросла на 14,3%. Штаммы генотипа Beijing в основном принадлежат к двум кластерам современной сублинии - В0/W148 (32,9%) и 94-32 (61,1%). Штаммы M. tuberculosis Beijing кластера B0/W148 играют ведущую роль в распространении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, обусловленной сочетанием замен rpoBSer531→Leu и katGSer315→Thr. УЧАСТИЕ В КОНФЕРЕНЦИЯХ: 2 устных доклада: XXII Кашкинские чтения (Санкт-Петербург); 50th World Conference on Lung Health (Hyderabad, India). 1 стендовый доклад: 40th Annual Congress of European Society of Mycobacteriology (Valencia, Spain). СТАТЬИ Mokrousov I, Akhmedova G, Polev D, Molchanov V, Vyazovaya A. Acquisition of bedaquiline resistance by extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strain of Central Asian Outbreak clade. Clinical Microbiology and Infection. 2019; 25:1295-1297. doi: 10.1016/j.cmi.2019.06.014. IF=6.4, WoS, Q1 https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1198743X19303398?via%3Dihub Vyazovaya A., E. Proshina, S. Toinova, A. Gerasimova, I. Avadenii, N. Solovieva, V. Zhuravlev, O. Narvskaya, I. Mokrousov. Population structure and epidemic resistant strains of Mycobacterium tuberculosis in the Komi Republic, Russian Federation: an imprint of historical and current demographics. Направлена в журнал Antimicrobial Agents and Chemotherapy (WoS, Q1)

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 году работы велись по следующим взаимосвязанным направлениям: - Исследование антимикобактериальной активности полученных в первый год новых соединений, содержащих аминобутанол и камфановые группы, на клинических штаммах M. tuberculosis: показан значительный разброс МИК для первого из эффективных соединений. - Синтез 109 новых модифицированных соединений - развитие результатов проведенного анализа соединений, полученных в 2019 году; определение МИК на референтом штамме. Тестирование 98 новых соединений двух различных классов дало интересные результаты и 2 статьи находятся в процессе написания. - Отработка биоинформационного анализа полногеномных секвенсов штаммов на предмет генетического полиморфизма, ассоциированного с резистентностью к ключевым антибиотикам нового поколения бедаквилину и перхлозону. Получены приоритетные данные по генетической основе резистентности и ее динамике в процессе длительной химиотерапии, опубликованы 2 статьи в журналах Q1 (одна из них отражена в Новостях на сайте РНФ https://рнф.рф/news/medicine/shtammy-vozbuditelya-tuberkuleza/). Также обновлена панель клинических изолятов для тестирования новых соединений. - Молекулярно-генетический анализ структуры популяции Mycobacterium tuberculosis в новом регионе РФ для выявления актуальных резистентных штаммов различных генотипов и обновления панели клинических изолятов для тестирования новых соединений Всего на данный момент опубликованы 4 статьи в зарубежных журналах WoS, в т.ч. 3 в Q1. Антимикобактериальная активность новых соединений, содержащих аминобутанол и камфановые группы, на клинических штаммах M. tuberculosis Скрининг исследуемых соединений был проведен на референтном штамме H37Rv. Самый эффективный препарат оказался CB-022A, 3,1 мкг/мл. Дополнительно три химических соединения DL-172, DL-173, DL-176 были протестированы на расширенной выборке клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis для определения МИК и была установлена их неэффективность. Наиболее эффективное соединение CB-022A было далее тестировано на клинических изолятах разных генотипов. Клинические изоляты представляли разные кластеры в пределах клинически/эпидемиологически значимого генотипа Beijing (B0/W148, 94-32, Central Asian Outbreak, древние сублинии) и различались по фенотипической лекарственной устойчивости (1 ШЛУ, 6 МЛУ, 2 полирезистентных и 2 чувствительных). Соединение CB-022A показало широкий диапазон МИК, который варьировал от 3,1 мкг/мл (H37Rv, древняя сублиния генотипа Beijing, большинство изолятов соврменногой сублинии эпидемического субтипа Beijing B0/W148) до 100 мкг/мл (другие изоляты). Это подчеркивает ключевую важность тестирования новых противотуберкулезных препаратов не только на эталонном лабораторном штамме H37Rv, который принадлежит к филогенетически маргинальной ветви M. tuberculosis, но и на клинически устойчивых изолятах, циркулирующих в странах с высоким бременем МЛУ-ТБ. Синтез новых модифицированных соединений. Развитие результатов проведенного анализа соединений в 2019 году. 109 новых веществ синтезировано на основе полученных результатов первого года и тестировано на референтом штамме (это количество значительно превышает план). Новые вещества, синтезированные в 2020 году, были протестированы на референтном штамме H37Rv. Получены результаты МИК по 98 веществам, из них 62 показали потенциальную эффективность на референтном штамме (МИК <6.25). Подавляющее большинство протестированных веществ имеют хорошую активность (<6,25 мкг/мл), особенно DO. DO-соединения представляют собой нитрофураны и нитроимидазолы, CA и CB-соединения представляют собой производные камфоры. Все соединения с МИК <6,25 мкг/мл снова проверяются в диапазоне 3,125 - 1,562 - 0,391 - 0,098 - 0,024 мкг/мл, чтобы окончательно определить их точную МИК. Одновременно, 4 из соединений, показавших МИК <6,25 (CB-45 DO-082 DO-092 DO-085) находятся в процессе тестирования на клинических штаммах. Отработка биоинформационного анализа полногеномных секвенсов штаммов на предмет генетического полиморфизма, ассоциированного с резистентностью к ключевым антибиотикам нового поколения бедаквилину и перхлозону. Мы получили приоритетные результаты как фундаментальные, так и прикладные, имеющие значение как для понимания особенностей микроэволюции и адаптации возбудителя в процессе длительного лечения, так и для персонализированной медицины больных туберкулезом. Выявленные штаммы, устойчивые к данным антибиотикам будут включены в расширенную панель штаммов для тестирования новых соединений, которые будут получены в рамках данного проекта. В исследование были включены пациенты Калининградского областного туберкулезного диспансера, получавшие бедаквилин в составе химиотерапии. ДНК штаммов подвергали полногеномному секвенированию на платформах MiSeq или NextSeq 500 (Illumina). Данные были депонированы в архиве SRA NCBI (проекты PRJNA525341 и PRJNA635788). Короткие прочтения были выровнены на полный геном эталонного штамма H37Rv (NC_00962.3) с использованием программы Geneious 9 (Biomatters). Белковые структуры были предсказаны с помощью веб-портала Phyre2 (www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2) и визуализированы с помощью инструмента UCSF Chimera (www.cgl.ucsf.edu/chimera). Сорок три изолята M. tuberculosis были выделены от 11 пациентов. Все изоляты были отнесены к генотипу Beijing и его кластеру B0/W148 («российский успешный клон» (Mokrousov et al., 2013)) или кладе Central Asia Outbreak (Shitikov et al., 2019). Бедаквилин - новый противотуберкулезный препарат, но, как и в случае с другими препаратами, M. tuberculosis может приобрести устойчивость к бедаквилину во время длительного лечения. В частности, мутации atpE предотвращают взаимодействие препарата с его мишенью, АТФ-синтазой, а мутации в репрессоре эффлюксной помпы mmpR (Rv0678) приводят к экспорту бедаквилина. В целом мы идентифицировали десять мутаций в генах устойчивости к бедаквилину у 6 из 11 пациентов. Насколько нам известно, большинство выявленных мутаций ранее описаны не были. У одного пациента мутация Rv0678 присутствовала до начала лечения. У другого пациента мутация Rv0678 была обнаружена в 80% считываний в первом изоляте, восстановленном после 13 дней лечения, что представляется слишком коротким периолом для возникновения и фиксации мутации. У четырех других пациентов мутации в Rv0678 или atpE возникли во время лечения бедаквилином. Далее мы оценили возможное влияние выявленных мутаций на функцию белка. Мутации со сдвигом рамки в Rv0678 значительно изменяют его аминокислотную последовательность что, приводит к потере функции и эффлюксу бедаквилина. Влияние мутаций на белковые структуры оценивали с помощью структурного анализа in silico и на основе оценки электростатического потенциала вокруг мутировавших аминокислот и анализировали в свете предыдущих исследований. Принимая во внимание приведенный выше анализ, мы сравнили результаты лечения с наличием и прогнозируемым эффектом мутаций Rv0678 и atpE. Это показало, что лечение было эффективным только у пациентов, изоляты которых не имели мутаций. Неудача лечения наблюдалась у всех шести больных, изоляты которых имели мутации по сравнению с одним из пяти случаев без мутаций (P = 0,03). Иначе говоря, успех лечения был возможен только в случаях когда инфицирующий штамм имел дикий тип генов Rv0678 и atpE. Таким образом, наши результаты показывают, что устойчивость M. tuberculosis к бедаквилину часто развивается во время длительного лечения и мутации в Rv0678 представляют основной механизм устойчивости к этому новому антибиотику. Гетерорезистентность была частым явлением, доля аллелей дикого типа и мутантных аллелей колебалась во времени, и отмечено появление новых мутаций через несколько месяцев после прекращения лечения (из-за очень длительного периода полувыведения бедаквилина из организма). Результат лечения был отрицательным для всех пациентов, инфицированных изолятами, несущими мутации Rv0678 или atpE независимо от их присутствия, доли или предполагаемого влияния на функцию белка. Штаммы эпидемических и мульти/широкорезистетных субтипов Beijing B0/W148 и Beijing CAO, активно циркулирующие в России и Средней Азии, быстро приобретают устойчивость и к новому антибиотику бедаквилину. Это может иметь серьезное негативное влияние на контроль МЛУ/ШЛУ-ТБ в России и странах бывшего Советского Союза в целом, где доминируют эти эпидемические и гипервирулентные генотипы M. tuberculosis. Анализ мутаций, предположительно ассоциированных с устойчивостью Mycobacterium tuberculosis к перхлозону, новому тиосемикарбазону Перхлозон ((PCZ) 4-тиоуреидо-иминометилпиридиния перхлорат) - новый тиосемикарбазон, одобренный для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) в России. PCZ представляет собой пролекарство, активируемое монооксигеназой EthA и ингибирующее дегидратазный комплекс FASII HadABC. Соответственно, мутации в ethA и hadABC могут придавать устойчивость к PCZ. В то же время известно, что мутации ethA опосредуют устойчивость к этионамиду (ETH) и протионамиду (PTH), достаточно широко применяемым для химиотерапии. Цель исследования - выявить мутации устойчивости к PCZ у изолятов M. tuberculosis в процессе лечения больных туберкулезом с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) возбудителя. Серийные изоляты M. tuberculosis были выделены от больных, леченных по схеме, включающей перхлозон (n=9), и без него (n=2). Полногеномное секвенирование проводили на платформе MiSeq (Illumina). Файлы fastq проанализированы с использованием Geneious 9 (Biomatters) и PhyReSE. Всего было выделено 43 изолята от 11 пациентов. Все изоляты M. tuberculosis принадлежали к генотипу Beijing. Мы идентифицировали мутации в генах, предположительно связанных с устойчивостью к PCZ - ethA и hadA. Наиболее частая из них - сдвиг рамки считывания ethA 106GA> G (7 из 9 пациентов), и большинство других мутаций, вероятно, также присутствовало до лечения PCZ. Остальные три мутации были обнаружены в одном или двух случаях, и две из них сопровождались уже упомянутой мутацией ethA 106 GA> G. Таким образом, хотя появление устойчивости к PCZ во время лечения PCZ было редким, мы выявили частое присутствие мутаций перекрестной устойчивости к PCZ и ETH/PTH до начала лечения PCZ. Это вызывает серьезную озабоченность в связи с возможной неэффективностью PCZ в лечении значительного числа случаев МЛУ-ТБ, изоляты которых могут быть дополнительно устойчивы к ETH/PTH. Ввиду высокого и постоянно растущего бремени МЛУ-ТБ в России для лечения таких пациентов часто используются ETH и PTH и их курс лечения может длиться 18-24 месяцев, и устойчивость к ETH/PTH может возникать довольно часто. Схемы лечения пациентов с ШЛУ-ТБ включают несколько препаратов, и наличие мутаций устойчивости к PCZ не обязательно связано с неудачей лечения. Однако включение дополнительного и неэффективного препарата в схему лечения нецелесообразно и может быть неблагоприятным для здоровья и благополучия пациента. Молекулярно-генетический анализ структуры популяции Mycobacterium tuberculosis в Вологодской области. Из 82 штаммов M. tuberculosis, выделенных от впервые выявленных больных ТБ в Вологодской области, 41,5% были лекарственно-чувствительными (ЛЧ), 18,3% – моно- и полирезистентными. МЛУ обладали 40,2% штамма (включая ШЛУ – 2 штамма). Доля МЛУ штаммов у больных ВИЧ/ТБ (77,8%) существенно превышала таковую у ВИЧ-отрицательных больных ТБ (32,9%) (p=0.01). Установлена принадлежность 62,2% (51 из 82) штаммов M. tuberculosis к генотипу Beijing. Штаммы генотипа Beijing относились к современной сублинии, превалирующей в российской популяции M. tuberculosis. MIRU-VNTR-типирование 51 штамма Beijing M. tuberculosis выявило 22 варианта паттернов (профилей) (HGDI=0.852). Суммарно доля МЛУ штаммов non-Beijing составила 7,3% (не было ни одного ШЛУ штамма). Таким образом, исследование выявило гетерогенность популяции M. tuberculosis, в которой более половины (62%) циркулирующих штаммов принадлежали к генотипу Beijing. При этом доля известного в России и за ее пределами эпидемиологически и клинически значимого кластера Beijing B0/W148 составила лишь 7%, что значительно меньше, чем в других регионах СЗФО РФ (҃~19%). Вместе с тем, в структуре генотипов и среди МЛУ штаммов M. tuberculosis преобладали представители кластера Central-Asian/Russian генотипа Beijing. Отобраны штаммы для тестирования новых соединений с потенциальной противотуберкулезной активностью.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году работы велись по следующим взаимосвязанным направлениям: - Исследована антимикобактериальная активность наиболее эффективных 9 новых соединений (производные камфоры и нитрофураны), на панели резистентных клинических штаммов M. tuberculosis: особенно интересные результаты с низкими значениями МИК показаны для нескольких нитрофуранов. В целом сделан вывод о перспективности направления поиска новых эффективных противотуберкулезных препаратов среди производных камфоры и особенно нитрофуранов. - Исследована цитотоксичность выборки соединений разных классов и показано что тестируемые соединения, а именно аминобутанолы, производные камфоры и нитрофураны не проявляют или проявляют только очень слабую цитотоксичность, что указывает на возможность их использования. - Подана заявка на патент заявка на патент на изобретение на соединение (нитрофуран), обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, и способ его получения - Дана оценка возможного механизма устойчивости к одному из новых нитрофуранов in vitro и in silico - проведен анализ корреляции генетических вариаций, возникающих в процессе длительного лечения новым антибиотиком бедаквилином и уровнем фенотипической устойчивости M. tuberculosis - результаты представлены на 4 международных конгрессах (1 устный и 3 стендовых доклада) КАМФОРНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ КАК СОЕДИНЕНИЯ ЭФФЕКТИВНЫЕ ПРОТИВ ШТАММОВ С МНОЖЕСТВЕННОЙ ИЛИ ШИРОКОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ Цитотоксичность камфановых соединений Чтобы изучить терапевтическое окно для будущего применения этих соединений в качестве противомикробных / противотуберкулезных средств, мы проанализировали их влияние на жизнеспособность человеческих клеток. Мы измерили жизнеспособность клеток с помощью колориметрического анализа (MTT). МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид) измеряет активность клеточных ферментов, которые восстанавливают тетразолиевый краситель, МТТ, до нерастворимого формазана, придавая ему пурпурный цвет. Мы использовали семь различных линий клеток человека, включая раковые и незлокачественные клетки. Клетки Hela получены из рака шейки матки, HepG2 - это клетки, полученные из рака печени, MIA PaCa - это линия клеток рака поджелудочной железы человека, KMST - это неопухолевые клеточные линии фибробластов человека, человеческие эмбриональные стволовые клетки Висконсина-Мэдисона называются WA13, эмбриональная почка человека 293 клетки обозначены как HEK293, а WI-38 представляет собой диплоидные человеческие фибробласты, происходящие из легочной ткани плода женского пола. Клетки высевали в 96-луночные планшеты и подвергали воздействию четырех различных концентраций трех разных аналогов камфоры в течение 72 часов. Тестируемые соединения, а именно CB-33A, CB-27A и CB-24, не проявляют или проявляют только очень слабую цитотоксичность, независимо от раковых свойств проанализированных линий клеток человека, что указывает на низкую цитотоксичность этих соединений и их использование. поскольку антибиотики могут обеспечить значительное терапевтическое окно. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) для новых соединений НА ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUIBERCULOSIS РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ И ПРОФИЛЕЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ Исследование антимикобактериальной активности проводили методом двукратных серийных микроразведений в жидкой синтетической среде Миддлбрука (Middlebrook 7H9 BrothBase, Sigma-Aldrich, кат. № M0178) с 10% ростовой добавки OADC (BBL Middlebrook OADC Enrichment, Becton Dickinson, кат. №245116) в 96-луночном планшете с индикацией роста микобактерий с помощью 0,01% резазурина (Resazurinsodiumsalt, Sigma, кат. № R7017) (метод REMA – Resazurin Microdilution Assay; Palomino et al., 2002) и регистрацией роста с помощью планшетного флуориметра FLUO Star Optima (длина волны возбуждения – 530 нм, излучения – 590 нм). В качестве тест-штаммов использовали: 1) чувствительный к противотуберкулезным препаратам штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv; 2) 14 клинических штаммов из коллекции ФГБУ "Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии" Минздрава России с различным типом лекарственной устойчивости (множественная лекарственная устойчивость, широкая лекарственная устойчивость). На основании генотипирования штаммы были отнесены к основным генетическим семействам российской популяции M. tuberculosis – Beijing и LAM (Latin American Mediterranean). Результаты определения МИК для DO-190, DO-209, DO-211 можно рассматривать как исключительно успешные - всего 2 штамма показало относительно высокие МИК, но в целом значения МИК даже лучше, чем, например, у этамбутола. Например, известный новый антибиотик бедаквалин имеет значения в лучшем случае около 0,03 микромоль. Более того хорошие или даже отличные значения МИК были получены на устойчивых штаммах разных генотипов как Beijing так и LAM причем наиболее опасных эпидемических геновариантов. Исследование антимикобактериальной активности проводили методом двукратных серийных микроразведений в жидкой синтетической среде Миддлбрука (Middlebrook 7H9 BrothBase, Sigma-Aldrich, кат. № M0178) с 10% ростовой добавки OADC (BBL Middlebrook OADC Enrichment, Becton Dickinson, кат. №245116) в 96-луночном планшете с индикацией роста микобактерий с помощью 0,01% резазурина (Resazurinsodiumsalt, Sigma, кат. № R7017) (метод REMA – Resazurin Microdilution Assay; Palomino et al., 2002) и регистрацией роста с помощью планшетного флуориметра FLUO Star Optima (длина волны возбуждения – 530 нм, излучения – 590 нм). В качестве тест-штаммов использовали: 1) чувствительный к противотуберкулезным препаратам штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv (TBC # 1/47, источник – Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, 1976 г., получен из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России);2) 14 клинических штаммов M. tuberculosis – Beijing и LAM (Latin American Mediterranean). Наиболее эффективное соединение среди производных камфоры CB-022A было далее тестировано на клинических изолятах разных генотипов. Клинические изоляты M. tuberculosis представляли разные кластеры в пределах клинически/эпидемиологически значимого генотипа Beijing (B0/W148, 94-32, Central Asian Outbreak, древние сублинии) и различались по фенотипической лекарственной устойчивости (1 ШЛУ, 6 МЛУ, 2 полирезистентных и 2 чувствительных). Соединение CB-022A показало широкий диапазон МИК, который варьировал от 3,1 мкг/мл (H37Rv, древняя сублиния генотипа Beijing, большинство изолятов соврменногой сублинии эпидемического субтипа Beijing B0/W148) до 100 мкг/мл (другие изоляты). Это подчеркивает ключевую важность тестирования новых противотуберкулезных препаратов не только на эталонном лабораторном штамме H37Rv, который принадлежит к филогенетически маргинальной ветви M. tuberculosis, но и на клинически устойчивых изолятах, циркулирующих в странах с высоким бременем МЛУ-ТБ. Применительно к нитрофуранам, особенно интересные результаты с низкими значениями МИК (0,03-0,06 мкг/мл) показаны для нескольких нитрофуранов. Результаты для некоторых соединений (напр. DO-166, DO-190, DO-209, DO-211) можно рассматривать как исключительно успешные - всего 2 штамма показало относительно высокие МИК, но в целом значения МИК даже лучше, чем, например, у этамбутола. Например, известный новый антибиотик бедаквалин имеет значения в лучшем случае около 0,03 микромоль. Более того хорошие или даже отличные значения МИК были получены на устойчивых штаммах разных генотипов как Beijing так и LAM причем наиболее опасных эпидемических геновариантов В целом сделан вывод о перспективности направления поиска новых эффективных противотуберкулезных препаратов среди производных камфоры и особенно нитрофуранов. Заявка на патент на один из наиболее эффективных нитрофуранов направлена в Роспатент. Задача изобретения – синтез нового соединения, обладающего противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, и способ его получения. Техническими результатами является разработка простого способа синтеза соединения формулы 1; выявленная противотуберкулезная активность in vitro соединения формулы 1, которая может позволить использовать его в разработке лекарственных средств для терапии туберкулеза. НЕПРЯМАЯ ОЦЕНКА МЕХАНИЗМА УСТОЙЧИВОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К НИТРОФУРАНАМ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ПОЛНОГЕНОМНЫХ ДАННЫХ Вещества обозначенные выше как DO относятся к нитрофуранам. Определенный разброс МИК при тестировании наиболее эффективных (на референс штамме) на клинических допускает наличие генетических механизмов устойчивости, не в связи с ее развитием в процессе искусственного ин витро мутагенеза (как прокси-приближение лечения больного), а в результате ранее приобретенных случайных мутаций. В свете информации о возможных генах ассоциированных с устойчивостью к нитрофуранам у бактерий, мы изучили полногеномные последовательности штаммов. МИК наиболее активных нитрофуранов для лекарственно-устойчивых изолятов M. tuberculosis) для которых были определены МИК к новым нитрофурановым соединениям с высокой противотуберкулезной активностью, на предмет полиморфизма в кандидатных генах резистентности к нитрофуранам. Мы проанализировали полногеномные последовательности на предмет полиморфизма генов, которые могли опосредовать устойчивость к нитрофуранам. В результате, у штаммов 3053 и 2229 в гене GlfT1 обнаружена мутация в геномной позиции 4229167 Т>C. Проверка наличия этой мутации в базе данных GMTV выявила ее у штаммов генотипа Beijing. В то же время, как было установлено нами ранее, данные два штамма устойчивы к новому антибиотику бедаквилину за счет мутаций в гене регуляторе эффлюксной помпы Rv0678 и возможно их повышенная МИК (2,5 мкг/мл в сравнении с МИК референс-штамма H37Rv 0,16 мкг/мл) может быть связана именно с этим механизмом активного выброса. Других мутаций у штаммов с увеличенным значением МИК для изученных нитрофуранов выявлено не было, что позволяет нам предположить что по крайней мере «врожденная» устойчивость к этим соединениям среди изученных мульти- и широкорезистентных штаммов отсутствует. ИСКУССТВЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ДЛЯ ОЦЕНКИ СПОНТАННЫХ МУТАЦИЙ УСТОЙЧИВОСТИ К НИТРОФУРАНАМ И РИСКА РАЗВИТИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К НИМ В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ Целью данного исследования было определение возможного генетического механизма устойчивости микобактерий туберкулеза к нитрофурановым соединениям. Синтезированным в данном проекте. Для исследования выбран Нитрофуран DO-166 показавший высокую эффективность (т.е. низкий МИК) для лабораторного штамма H37Rv (0,16 мкг/мл). Полногеномное секвенирование пулов мутантов полученных при разных концентрациях нитрофурана DO-166 выявило мутации на наибольшей из использованных концентраций при сравнении с исходным полным геномом штамма H37Rv (СПб НИИФ). Определение геномных вариаций было сделано посредством анализа всех файлов fastq с помощью ресурса Phyresse.org с последующей проверкой полученных потенциальных вариаций в программе Geneious (наличие, истинность и процент мутантных аллелей). Всего было выявлено 6 SNP с долей мутантных аллелей от 15 до 25% mutants. Это отражает возможное селективное давление данного соединения DO-166 на несколько генов, относящихся к различным функциональным категорияч: клеточная стенка и клеточные процессы, промежуточный обмен веществ и дыхание, инсерционные последовательности и фаги.