Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. Изучение каталитических свойств и механизма действия нанозимов на основе берлинской лазури. Для изучения механизма действия нанозимов был применен формально-кинетический подход, принятый в ферментативной кинетике. За реакцией восстановления пероксида водорода, катализируемого нанозимами, следили по уменьшению концентрации восстановленной формы второго субстрата (или накоплению его окисленной формы) спектрофотометрически. Кинетика реакции восстановления Н2O2, катализируемой синтезированными нанозимами на основе берлинской лазури, исследована в присутствии наиболее используемых субстратов фермента пероксидазы. Механизм восстановления пероксида водорода, катализируемый нанозимами на основе берлинской лазури, описывается двустадийной схемой. Первой является обратимая стадия взаимодействия нанозимов с восстанавливающим субстратом, которая протекает по бимолекулярному механизму без образования комплекса. Окисление берлинского белого, восстановленной формы берлинской лазури, пероксидом водорода на второй стадии протекает необратимо. Соотношение прямой и обратной констант первой стадии определяется разностью потенциалов медиатора и берлинской лазури (PB|PW). Таким образом, нанозимы на основе каталитически синтезированных наночастиц берлинской лазури являются низкопотенциальной «искусственной пероксидазой» (≈0.15 В, Ag|AgCl), вплоть до 200 раз превосходящей по каталитической константе природный фермент даже в присутствии высокопотенциальных восстанавливающих субстратов. 2. Стабилизация нанозимов: синтез композитных наночастиц ядро-оболочка с ядром из каталитического материала (гексацианоферрат железа) и стабилизирующей оболочкой (гексацианоферрат никеля). С целью синтеза стабилизированных нанозимов ядро из каталитического материала – берлинская лазурь – покрывалась оболочкой гексацианоферрата никеля, изоструктурного берлинской лазури, но, хотя и каталитически неактивного, гораздо более стабильного механически и химически. Разработан протокол синтеза стабилизированных нанозимов. После инкубации в смеси солей никеля и гексацианоферрата диаметр наночастиц берлинской лазури возрастает. Размеры получаемых наночастиц, определенные с помощью метода динамического светорассеяния, составили от 40-50 нм до >100 нм, что подтверждается данными просвечивающей электронной микроскопии. Оптимальным для стабилизированных нанозимов является каталитический синтез наночастиц берлинской лазури диаметром ≈40 нм с последующим покрытием их слоем гексацианоферрата никеля до диаметра ≈80 нм. Стабильность полученных композитных наночастиц в нейтральной среде (pH 7.4), охарактеризованная константой инактивации, повышена на порядок по сравнению с нанозимами на основе берлинской лазури. Путем модификации поверхности рабочего электрода стабилизированными нанозимами разработаны сенсоры на пероксид водорода, определена их чувствительность и операционная стабильность. Эти исследования будут продолжены на 2 году выполнения проекта. 3. Синтез сверхмалых нанозимов «искусственная пероксидаза» с размерами на уровне размеров ферментов (4-6 нм). Осуществлен синтез наночастиц берлинской лазури размером 4-5 нм в трехфазных системах вода/октан/ПАВ путем восстановления смеси феррицианида и хлорида железа (III) с использованием анилина в качестве восстановителя. Получено распределение ультрамалых наночастиц берлинской лазури частиц по размерам методами динамического светорассеяния и просвечивающей электронной микроскопии. Средний диаметр частиц составил 4.4±0.3 нм. Ультрамалые наночастицы БЛ стабилизированы в водном фосфатно-цитратном буферном растворе (рН 5.0) путем включения в мицеллы Triton X-100. Исследована каталитическая активность ультрамалых наночастиц берлинской лазури, получены kcat/KM ≈ 0.36*10-3 с-1M-1 по ТМБ и kcat/KM ≈ 0.65 с-1M-1 по H2O2. Эти работы также будут продолжены на 2 году выполнения проекта. 4. Электрохимический синтез нанозимов «искусственная пероксидаза» с ис- пользованием проточных электродов. Для регулируемого электрохимического синтеза нанозимов на основе берлинской лазури разработана проточная ячейка типа wall-jet с возможностью интеграции сменных электродов на основе графитового войлока. Показана возможность потенциостатического синтеза наночастиц берлинской лазури в системе, при этом размер частиц регулируется задаваемым потенциалом. Возможность синтеза наночастиц электрохимически позволяет достичь большей воспроизводимости свойств материала, чем в случае химического осаждения. С другой стороны, такой подход масштабируем и пригоден для массового производства препаратов электроактивных наночастиц. Электрохимически синтезированные наночастицы берлинской лазури имеют узкое распределение по размерам. Для всех синтезированных образцов каталитическая активность в реакции восстановления Н2O2 в присутствии тетраметилбензидина превосходит таковую для фермента пероксидазы из корней хрена. Для частиц с диаметром 135 нм kкат составляет ≈ 7500 с-1, что в 35 раз выше, чем для пероксидазы. 5. Осаждение нанозимов «искусственная пероксидаза» на электроды для изучения их электрокаталитических свойств в сравнении с обычными электродами, модифицированными берлинской лазурью. Покрытия на основе иммобилизованных нанозимов на основе берлинской лазури обладают высокой электроактивностью. В редокс-процессе задействована вся толщина покрытия, при этом доля электроактивного материала определяется размером частиц, при увеличении последнего доля экспоненциально приближается к 25%. Предложенный способ иммобилизации нанозимов на поверхности электрода прост, позволяет контролировать размер наносимых частиц и, как результат, плотность и морфологию электроактивного покрытия. Развитая морфология поверхности сенсоров на основе наночастиц берлинской лазури позволяет достичь чувствительности по отношению к Н2О2 (0.85±0.05 А·М-1·см-2, n=3, P=0.95), на 30 % превосходящей таковую для сенсоров на основе пленок БЛ. Время единичного измерения с помощью таких сенсоров и биосенсоров не превышает 10 с, а линейный диапазон определяемых концентраций H2O2 охватывает 4 порядка величины: от 2·10-7 до 1·10-3 М. Коэффициент чувствительности биосенсора на лактат в периодическом режиме тестирования, составляет 210 ± 20 мА·М-1·см-2, что в 2 раза выше чувствительности аналогичного биосенсора, модифицированного пленкой БЛ. Результаты работы опубликованы: Vokhmyanina Darya V., Andreeva Ksenia D., Komkova Maria A., Karyakina Elena E., Karyakin Arkady A.‘Artificial peroxidase’ nanozyme – enzyme based lactate biosensor. Talanta, 2020, 208, 120393 DOI: 10.1016/j.talanta.2019.120393 6. Исследование наночастиц «искусственная пероксидаза» физическими и физико-химическими методами. Фазовый состав каталитически синтезированных наночастиц на основе берлинской лазури подтвержден методами рентгенофазового анализа, мессбауэровской спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния. Катализатор, синтезируемый в присутствии ряда органических мономеров, представляет собой композит берлинская лазурь/проводящий полимер. Гранулометрический анализ наночастиц берлинской лазури осуществлен методами динамического светорассеяния, растровой электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, полученные результаты согласуются. Частицы берлинской лазури имеют субмикро- и наноразмеры, а их диаметр можно контролировать на стадии синтеза. Гидратный состав НЧ БЛ установлен методом термогравиметрии. Высокий коэффициент экстинкции ε=4.85·104 М-1·см-1 наночастиц БЛ (определен методами спектроскопии и масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой) позволяет рассматривать их в качестве потенциально применимых колориметрических меток для создания ДНК-/РНК-биосенсоров. 7. Аналитический обзор литературных источников. По материалам выполняемого проекта и проекта РНФ, успешно завершенного в 2018 году, и также основанного на применении электрокатализатора на основе Берлинской лазури авторы подают заявку на написание обзора литературы по теме “Берлинская лазурь: от высокоэффективного электрокатализатора восстановления пероксида водорода до нанозимов, побеждающих природный фермент пероксидазу” в редакцию журнала Успехи химии для публикации в 2020-21 гг. 8. Дополнительно к заявленному Плану работ на 1 год проекта разработан амперометрический способ детекции неэлектроактивных ионов и нейтральных молекул, альтернативный классической потенциометрии. Поскольку берлинская лазурь представляет собой ред-окс активный материал, обменивающийся катионами с раствором для компенсации заряда, ее целесообразно использовать в качестве сенсора на катионы щелочных металлов. Для детекции неэлектроактивных ионов в качестве альтернативы традиционной потенциометрии предложена амперометрия в проточно-инжекционном режиме. Отклик сенсора представляет собой пару разнонаправленных пиков (катодный и анодный) в проточно-инжекционном режиме и один пик в режиме постоянного потока аналита. Сравнительные исследования показали, что проточно-инжекционном режиме аналитически значимым является первый пик. По своим аналитическим характеристикам амперометрический режим превосходит потенциометрический: соотношение сигнал-шум повышается в 20-25 раз. Результаты исследования опубликованы: Zavolskova Marina D., Nikitina Vita N., Maksimova Ekaterina D., Karyakina Elena E., Karyakin Arkady A. Constant Potential Amperometric Flow-Injection Analysis of Ions and Neutral Molecules Transduced by Electroactive (Conductive) Polymers Analytical Chemistry, 2019, 91, № 12, 7495-7499 DOI 10.1021/acs.analchem.9b00934 9. Подготовлено к публикации 5 статей (Q1), из них две уже опубликованы. 10. Подготовлена к защите кандидатская диссертация аспирантки Карповой Е.В. (защита 18 декабря 2019 г.). Участники работ по гранту приняли участие в 5 конференциях в РФ и за рубежом, также в конкурсах и выставках, отмечены премиями и стипендиями.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Скриннинг органических соединений как восстановителей смеси соли железа (III) и феррицианида для синтеза нанозимов. Синтез нанозимов за счет восстановления смеси соли железа (III) и феррицианида органическими соединениями. Был осуществлен синтез наночастиц с использованием в качестве восстановителей для смеси соли железа (III) и феррицианида предшественников проводящих полимеров: пиррола, анилина, тиофена, а также их производных. Включение проводящего полимера в состав наночастиц берлинской лазури, помимо функционализации, приводит к стабилизации катализатора. Наибольшую операционную стабильность, заметно превосходящую таковую не только для нефункционализированных наночастиц, но и для пленок берлинской лазури, демонстрируют нанозимы на основе самодопированного полианилина (полимера 3-аминофенилборной кислоты). Одной из наиболее удобных функциональных групп для последующей конъюгации с биомолекулами является азид (клик-реакцией азид-алкинового циклоприсоединения). Для функционализации азидо-группами осуществлен синтез нанозимов с использованием азидометил-ЭДОТа (азидометил-этилендиокситиофена) в качестве восстановителя феррицианида железа (III). Функционализация наночастиц подтверждена методом рамановской спектроскопии. 2. Заключительная оптимизация методов синтеза нанозимов, разрабатываемых в течение первого года проекта (электрохимический, ядро-оболочка, сверхмалых нанозимов). 2.1. Проведена заключительная оптимизация условий электрохимического синтеза нанозимов «искусственная пероксидаза». Размер наночастиц, синтезируемых в проточной ячейке типа wall-jet с интегрированным электродом на основе углеродного волокна, определяется в основном концентрацией реагентов и восстановительным потенциалом. При этом увеличение концентрации солей и снижение потенциала приводят к уменьшению диаметра наночастиц (до 50-60 нм). Заключительная оптимизация условий электрохимического синтеза позволила синтезировать нанозимы с каталитической константой, до 200 раз превосходящей kкат для пероксидазы из корней хрена. Будучи простым и безреагентным, электрохимический подход также позволяет осуществлять контроль размера нанозимов на стадии синтеза, что делает его перспективным для задач биотехнологии. 2.2. Стабилизированные нанозимы ядро-оболочка были синтезированы путем экспонирования наночастиц берлинской лазури (БЛ) в растворы, содержащие ионы никеля (Ni2+) и ферроцианида ([Fe(CN)6]3‒) для покрытия гексацианоферратом никеля (NiГЦФ). В качестве стабилизатора получаемых наночастиц использовали гексаметафосфат натрия. Стабильность нанозимов ядро-оболочка в нейтральных pH, характеризуемую оптической плотностью при 700 нм (берлинская лазурь), судя по константе инактивации, удалось повысить почти на порядок, в частности, для частиц диаметром ≈120 нм kin (БЛ) = 2.4∙10-3 с-1, kin (БЛ-NiГЦФ) = 3.1∙10-4 с-1. Сенсоры на пероксид водорода (методика их создания на основе наночастиц разработана в течение первого года выполнения проекта) в случае использования нанозимов ядро-оболочка также характеризуются значительно более высокой операционной стабильностью. Так в жестких условиях мониторирования 1 мМ пероксида водорода для сенсоров на основе наночастиц БЛ-NiГЦФ время полуинактивации в 3 раза выше, а константа инактивации в 5 раз ниже, чем для сенсоров на основе наночастиц берлинской лазури. 2.3 Проведена оптимизация условий синтеза сверхмалых нанозимов на основе берлинской лазури в системах обращенных мицелл (октан/АОТ/вода). Синтез проводили каталитическим способом: к мицеллярной смеси, содержащей соли гексацианоферрата железа (III) и хлорида железа (III), добавляли мицеллярный раствор восстановителя – анилина. Методом динамического светорассеяния определен средний диаметр наночастиц в мицеллярной среде: 4.7±0.5 нм, что подтверждено просвечивающей электронной микроскопией. Получить нанозимы сверхмалых размеров (7 нм) в водном растворе возможно после однократного осаждения ацетоном из мицеллярной системы и ресуспендирования в фосфатно-цитратном буферном растворе при рН 5.0. 3. Исследование полученных нанозимов физическими и физико-химическими методами. Фазовый состав наночастиц берлинской лазури, стабилизированных гексацианоферратом никеля (частицы типа «ядро-оболочка»), исследовали методом ИСП МС. Для образцов с высоким содержанием ГЦФ никеля соотношение Fe:Ni стремится к 1. Согласно данным просвечивающей электронной микроскопии, образцы с высоким и низким содержанием гексацианоферрата никеля состоят из слабокристаллических зерен со средним размером 7-20 нм. Для обоих образцов зерна агрегированы в более крупные частицы размером 40-150 нм. Согласно данным локального рентгеноспектрального анализа, соотношение Fe и Ni для стабилизированных наночастиц с d = 40 нм составляет около 13, для наночастиц с d = 115 нм – около 3. Предположительно синтез наночастиц типа «ядро-оболочка» протекает как путем адсорбции ГЦФ никеля на поверхности наночастицы БЛ, так и путем агрегации с коллоидными частицами ГЦФ никеля, образующимися в реакционной смеси. Наночастицы большого диаметра с высоким содержанием ГЦФ никеля представляют собой агломераты наночастиц берлинской лазури, покрытых тонким слоем ГЦФ никеля, и наночастиц ГЦФ никеля. 4. Исследование каталитических свойств полученных нанозимов. Зависимость начальной скорости каталитической реакции от концентрации субстратов практически всегда имеет вид функции Михаэлиса. Интегральная кинетика указывает на замедленный выброс продукта (окисленной формы восстанавливающего субстрата). Кинетический механизм действия нанозимов состоит из стадий: присоединения восстанавливающего субстрата, окисления полученного комплекса пероксидом водорода (необратимая каталитическая стадия) и выброса окисленной формы восстанавливающего субстрата. Каталитические константы скорости для низкопотенциальных субстратов катехола, пирогаллола и ферроцианида калия составляют 2.6±0.1∙107 М-1с-1, 1.3±0.1∙108 М-1с-1 и 1.9±0.1∙108 М-1с-1, соответственно, и превосходят константу скорости взаимодействия активного центра пероксидаз с H2O2: (1–2)∙107 М-1с-1. Однако для пероксидаз скорость-лимитирующей является реакция Соединения II с электрон-донорными субстратами, протекающая, как минимум, на порядок медленнее. Таким образом, скорость-лимитирующая стадия реакции восстановления пероксида водорода, катализируемой нанозимами, как минимум в 100 раз превосходит таковую для реакции с участием пероксидаз. Для нанозимов типа «ядро-оболочка» каталитическая константа примерно в 2-2.5 раза ниже. Однако в нейтральных растворах ее значение для нестабилизированных наночастиц уменьшается на 50 % за 5 часов, в то время как нанозимы «ядро-оболочка» сохраняют до 80% ее величины в течение 50 часов. 5. Исследование органических пероксидов как субстратов нанозимов «искусственная пероксидаза». Каталитическая активность НЧ БЛ снижается в ряду пероксидов: пероксид водорода – пероксид мочевины – пероксид метилэтилкетона – трет-бутилгидропероксид – гидропероксид кумола. Установлено, что для небольших по размеру пероксидов (пероксиды водорода и мочевины) каталитическая реакция имеет место по всему объему наночастиц, восстановление больших пероксидов (трет-бутилгидропероксид, гидропероксид кумола) протекает только на поверхности нанозимов. Также установлено, что нанозимы не только каталитически активнее пероксидазы из корней хрена, но и более селективны к пероксиду водорода. Так для наночастиц (dср = 68 нм) коэффициенты селективности превышают таковые для пероксидазы хрена до 4 раз. Разрабатываемые нанозимы, таким образом, могут применяться в системах бесферментного определения пероксидов и биохимическом анализе. 6. Включение нанозимов «искусственная пероксидаза» в липосомы с целью создания противовоспалительных лекарств. Показана принципиальная возможность совместного включения каталитически синтезированных наночастиц БЛ (d = 50 нм) и миРНК в липосомы. Согласно данным динамического светорассеяния, диаметр гибридных наночастиц составляет около 100 нм. Включение наночастиц в липидный слой незначительно блокирует транспорт веществ, а каталитическая активность меняется не более чем на 30 %. Установлено, что каталитически синтезированные наночастицы БЛ, а также частицы типа «ядро-оболочка» на основе БЛ, стабилизированной гексацианоферратом никеля, не цитотоксичны. Проведены предварительные эксперименты, подтверждающие возможность аккумуляции наночастиц в клетках (AML12) и снижения таким образом уровня активных форм кислорода. 7. Синтез конъюгатов нанозимов с ДНК. С целью создания безреагентных электрохимических ДНК/РНК-сенсоров предложено использовать наночастицы берлинской лазури, функционализированные азидо-группами, позвляющими осуществить биоконъюгацию клик-реакцией азид-алкинового циклоприсоединения. На примере фрагмента гена HULC с использованием флуоресцентных меток установлено, что в полученных конъюгатах на один нанозим приходится в среднем 10-15 олигонуклеотидных фрагментов. Дзета-потенциалы нанозимов подтверждают протекание процесса биоконъюгации. Получены биоконъюгаты с различной удаленностью каталитической метки «искусственная пероксидаза» от 5′ конца (от 5 до 70 нуклеотидов). Показано, что электроактивность нанозимов в составе биоконъюгатов сохраняется. Таким образом, заложены основы использования нанозимов «искусственная пероксидаза» в качестве редокс/электрокаталитических меток. 8. Подготовка обзорной научной статьи. Исполнителями проекта получено приглашение подготовить к публикации главу в издании Comprehensive Inorganic Chemistry III (Elsevier). 9. Патентный поиск и подготовка патента. Получен патент на изобретение «Биосенсор на основе мембран полиалкоксисилана с повышенным коэффициентом чувствительности», 2 731 411, 2 сентября 2020 г. 10. Подготовка публикаций в высокорейтинговых журналах. На втором этапе настоящего проекта опубликовано 4 статьи в журналах Q1. Подготовлены к публикации 3 статьи: по механизму действия нанозимов, по электрохимическому синтезу нанозимов и по суперстабильным нанозимам «ядро-оболочка». 11. Участие в научных конференциях. Результаты работ по проекту представлены на трех Международных и Всероссийских научных конференциях, в том числе 71st Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry (Белград, Сербия). Конференции ESEAC-20 и Фрумкинский Симпозиум, указанные в плане, перенесены на 2021 год из-за коронавируса. 12. Участие студентов в научных конкурсах. Исполнители проекта получили награды за победы в научных конкурсах.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Исследование физико-химических и каталитических свойств сверхмалых нанозимов. Проведено всестороннее исследование сверхмалых нанозимов (d = 4-5 нм), синтезированных каталитически в обращенных мицеллах в течение предыдущих этапов проекта, физико-химическими методами (оптическими, электрохимическими). Установлено, что синтез нанозимов в системе обращенных мицелл при степени гидратации 10 позволяет получать структуры с диаметром менее 8 нм. На рамановском спектре нанозимов, синтезированных в обращенных мицеллах, наблюдаются пики соответствующие колебаниям характеристических групп в структуре берлинской лазури (БЛ). Уширенный пик при 1500 см-1 на спектре композитных наночастиц БЛ-полианилин следует отнести к структуре последнего. При этом колебания, соответствующие поверхностно-активному веществу (ПАВ), отсутствуют, свидетельствуя о полном удалении ПАВ при отмывке нанозимов. Сверхмалые нанозимы иммобилизовали на поверхности электрода путем адсорбции. На циклических вольтамперограммах наблюдается пара пиков при потенциале 0.12 В (отн. ХСЭ), соответствующая редокс-переходу берлинская лазурь/берлинский белый. Электроды с иммобилизованными сверхмалыми нанозимами были протестированы в режиме амперометрической детекции пероксида водорода. Малый размер частиц катализатора обеспечивает высокую чувствительность детекции Н2О2 – (0.74 ± 0.09 А∙М-1∙см-2). Каталитические свойства сверхмалых нанозимов на основе берлинской лазури исследовали в системе обращенных мицелл. Показано, что зависимость начальной скорости реакции восстановления пероксида водорода от степени гидратации имеет максимум в диапазоне последней от 7 до 10, что соответствует условиям синтеза нанозимов. Начальная скорость реакции имеет гиперболическую зависимость от концентрации восстанавливающего субстрата (пирогаллол, гваякол), типичную для ферментативной кинетики. Найденные из этих зависимостей каталитические константы, в свою очередь, линейно зависят от концентрации пероксида водорода. Из тангенса угла наклона полученных линейных зависимостей представляется возможным определить бимолекулярную константу второй, скорость лимитирующей стадии (k2). Константы скорости k2 составили 63 M−1 с−1 для пирогаллола и 0.83 M−1 с−1 для гваякола. Для сверхмалых нанозимов, синтезированных в мицеллах, тангенс угла наклона зависимости наблюдаемой каталитической константы от диаметра наночастиц в билогарифмических координатах составил 2.6, что свидетельствует о протекании катализа не только на поверхности, но также в объеме частицы. Значения констант, полученных для нанозимов, как в водной, так и в мицеллярной системах, принадлежат одной зависимости. Таким образом, каталитические свойства сверхмалых нанозимов типичны для каталитически синтезированных наночастиц на основе берлинской лазури. 2. Исследование свойств гибридных наночастиц нанозим-миРНК, включенных в липосомы, для снижения активных форм кислорода в клетках. В течение заключительного этапа проекта продолжены работы, направленные на разработку противоопухолевых лекарств. Присутствие берлинской лазури в составе гибридных наночастиц призвано обеспечить снижение уровня активных форм кислорода (АФК) в поврежденных клетках, а также способствовать повышению эффективности РНК интерференции, защищая миРНК от деградации. Установлено, что наночастицы на основе БЛ могут накапливаться в клетках гепатоцитов мыши (AML12). При этом нанозимы даже в высокой концентрации (до 100 мкМ БЛ) не оказывают влияния на митохондриальную активность клеток и не цитотоксичны. Методом проточной цитометрии с использованием красителя дихлорфлуоресцеина показано, что при введении нанозимов в культуру клеток наблюдается значительное (на 70 %) снижение уровня АФК. Показана принципиальная возможность совместного включения каталитически синтезированных нанозимов различного размера (30 нм и 120 нм) и миРНК в липидные частицы. Согласно данным динамического светорассеяния, размер гибридных наночастиц составляет 100-140 нм и определяется размером липидной оболочки. Включение нанозимов в состав липосом подтверждено методом электронной криомикроскопии. Увеличение дзета-потенциала наночастиц берлинской лазури после формулирования также косвенно подтверждает включение нанозима в липосомы. Исследована кинетика реакции восстановления пероксида водорода, катализируемой нанозимами в составе гибридной частицы. Каталитическая константа для наночастиц, включенных в липосомы, закономерно снижается, а константа Михаэлиса – увеличивается, по сравнению с таковыми для свободных нанозимов. Тем не менее, снижение каталитической активности незначительно. Более того, предполагается, что при доставке в клетки липидная оболочка будет разрушаться, высвобождая нанозимы и миРНК непосредственно в цитоплазму. Таким образом, синтезированные гибридные наночастицы обладают высокой каталитической активностью в реакции восстановления Н2О2 и потенциально применимы для терапии двойного действия, а в перспективе позволят существенно снизить уровень АФК в очагах воспаления для повышения эффективности РНК интерференции. 3. Синтез биоконъюгатов нанозим-олигонуклеотид/нанозим-антитело и исследование каталитических и электрокаталитических свойств нанозимов в их составе. С целью применения в иммунохроматографии были синтезированы нанозимы различного размера, а также композитные наночастицы БЛ/полианилин (также с включением антраниловой и аминофенилборной кислот), БЛ/полиэтилендиокситиофен (ПЭДОТ), БЛ/азидометил-ПЭДОТ и его конъюгаты. Установлено, что независимо от размера частиц (30 или 100 нм), поверхностного потенциала (-25 мВ или 4 мВ), использования ПАВ (полиэтиленгликоль, белки), движения наночастиц или их конъюгатов с олигонуклеотидами вдоль нитроцеллюлозной мембраны не наблюдается. Таким образом, замена наночастиц серебра и золота на нанозимы берлинской лазури в иммунохроматографическом анализе не представляется возможной. С целью создания безреагентных электрохимических ДНК сенсоров на втором этапе проекта были синтезированы функционализированные азидо-группами наночастицы берлинской лазури. В ходе завершающего этапа проекта показана эффективность катализа реакции одновалентной медью по Мельдалю и Шарплессу (CuAAC или Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition). Установлено, что использование катализатора позволяет значительно повысить эффективность конъюгации и, как результат, в 5-10 раз увеличить чувствительность детекции меченых олигонуклеотидов. Методом флуориметрии контролировали количество олигонуклеотидов на поверхности нанозима. В дальнейшем использовали конъюгаты, содержащие 10-20 последовательностей. Электрокаталитическая активность конъюгатов в реакции восстановления пероксида водорода изучалась после их иммобилизации на поверхности электрода. Установлено, что максимальные коэффициенты чувствительности в случае коньюгатов (0.41 А∙М-1∙см-2) лишь незначительно уступают таковым для неконъюгированных наночастиц БЛ/азидометил-ПЭДОТ (0.45 А∙М-1∙см-2). Наблюдаемая каталитическая константа в реакции восстановления пероксида водорода в присутствии катехола для биоконъюгатов (3∙104 с-1) менее чем в 2 раза уступает таковой для свободных нанозимных меток на основе композита БЛ/азидометил-ПЭДОТ (5.5∙104 с-1). При этом наблюдаемая константа Михаэлиса увеличивается почти в 2 раза (до 7 мМ), что, вероятно, обусловлено ограниченной диффузией субстрата к поверхности нанозима в составе конъюгата. Для получения конъюгатов с антителами синтезировали нанозимы с амино- и карбоксильными группами. Использовали антитела европейского кролика (Oryctolagus cuniculus), выработанные к иммуноглобулинам полевой мыши (Apodemus agrarius), а также антитела домашнего осла (Equus asinus), к иммуноглобулинам европейского кролика. Реакцию биоконъюгации проводили с помощью дициклогексилкарбодиимида. 4. Разработка и испытание электроаналитических систем на основе ДНК(РНК)-сенсоров/иммуносенсоров с использованием биоконъюгатов нанозим-олигонуклеотид/нанозим-антитело. Поверхность графитовых электродов модифицировали электрополимеризацией азидометил-ЭДОТ, толщина покрытия от 50 до 300 нм. Сохранение азидо-функциональности подтверждено методом спектроскопии нарушенного полного внутреннего отражения в инфракрасной области. Редокс превращения известных медиаторов (ферри-/ферроцианид) на поверхности азидометил-ПЭДОТ в физиологических рН характеризуются значительно более высокими электрохимическими константами по сравнению с чистым электродом. Для создания ДНК- и иммуно-сенсоров олигонуклеотиды иммобилизовали на поверхности как азидометил-ПЭДОТ, так и нанозимов клик-реакцией, антитела коньюгировали с нанозимами карбодиимидным способом, на графитовой поверхности антигены и олигонуклеотиды закрепляли путем адсорбции. Регистрацию метки (нанозима) осуществляли по безмедиаторной реакции электровосстановления пероксида водорода. Показано, что специфическое взаимодействие, обусловленное гибридизацией комплементарных ДНК, приводит к увеличению чувствительности пероксидного сенсора по крайней мере на порядок. Определены градуировочные зависимости детекции олигонуклеотидов HULC, меченых нанозимами. Для электрода с азидометил-ПЭДОТ, снижающим неспецифическую сорбцию, минимальная детектируемая концентрация составила 0.1 нМ. Таким образом, разработанный подход пригоден для создания реальных ДНК сенсоров, работа которых, как предполагается, будет основана на гибридизации иммобилизованного на электроде и коньюгированного с нанозимом олигонуклеотидов с разными участками ДНК-мишени, которая, таким образом, будет приводить к иммобилизации электрокаталитической метки на электроде. Аналогично регистрировалась электрокаталитическая активность нанозима в отсутствии (неспецифическая сорбция) и в присутствии иммобилизованных антител. Возможно, ввиду экранирования белковыми молекулами прямой электрокатализ в данном случае оказывается неэффективным, поэтому в систему был добавлен медиатор (катехол). Показано, что специфическое связывание приводит к повышению чувствительности соответствующего пероксидного сенсора в 20 раз, таким образом, открывая перспективы создания реальных иммуно-сенсоров. Высокая электрокаталитическая активность разработанных нанозимов, а также возможность их ковалентной пришивки к биомолекулам (антителам и олигонуклеотидам) позволила разработать прототипы электрохимических иммуно- и ДНК сенсоров, которые позволят осуществлять экспрессную детекцию суб-наномолярных концентраций соответствующих аналитов. 5. Подготовка обзорной статьи и чтение пленарных лекций. Руководителю проекта было предложено написать обзорную статью для журнала Microchimica Acta (IF = 5.83, Q1), что было сделано по результатам проекта; обзор находится в печати. Руководитель проекта выступил с пленарными лекциями, посвященными результатам проекта на двух престижных международных конференциях. 6. Публикации в высокорейтинговых журналах. На третьем этапе по результатам проекта опубликовано 5 статей в журналах Q1: Journal of Physical Chemistry Letters (2) (IF = 6.475, Nature Index), Electrochimica Acta (IF = 6.9), Electrochemistry Communications (IF = 4.724), Dalton Transactions (IF = 4.39). 7. Участие в научных конференциях. Результаты работ по проекту представлены на Международных и Всероссийских научных конференциях: The Eighteenth International Symposium on Electroanalytical Chemistry (18th ISEAC), Changchun, China, XXVIth International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics, Cluj-Napoca, Romania, The 10th International Workshop on Surface Modification for Chemical and Biochemical Sensing, Warsaw, Poland, European Biosensor Symposium “EBS 2021 online”, Wildau, Germany. Студенты приняли участие в Международной научной конференции «Ломоносов-2021» (Москва, Россия). Конференции ESEAC-20 и Фрумкинский Симпозиум, указанные в плане, перенесены на 2022 год из-за коронавируса. 8. Участие студентов в научных конкурсах. Исполнители проекта получили награды за победы в научных конкурсах. 9. Защита курсовых и дипломных работ студентами химического факультета МГУ Под руководством участников научного коллектива выполнены и защищены с отличной оценкой 8 дипломных работ по аналитической химии, 4 дипломные работы отмечены аттестационной комиссией. Защищены 4 курсовые работы по аналитической и физической химии.