Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе первого года реализации проекта были разработаны пять прототипов ген-активированных гидрогелей на основе коллагена, гиалуроновой кислоты и других полимеров, в том числе содержащих микрочастицы фосфатов кальция, и плазмидной ДНК. С использованием генных конструкций, несущих один из генов маркерных белков (люцифераза и зеленый флуоресцентный белок) была определена эффективность доставки плазмидной ДНК каждым из вариантов гидрогелей, а также охарактеризована их биосовместимость. Экстракты всех вариантов гидрогелей в различных разведениях не оказывали цитотоксического действия на культуру мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, не влияли на миграционную активность клеток, но существенно снижали пролиферативную активность. Два варианта гидрогелей, содержащих микрочастицы фосфатов кальция, оказались цитотоксичны при ко-инкубировании с культурами клеток в непосредственном контакте. В культуре эмбриональных фибробластов мыши линии 3Т3 посредством флуоресцентной микроскопии, проточной цитофлуориметрии и люминисцентного исследования было показано, что ген-активированные гели на основе гиалуроновой кислоты и коллагена способны обеспечить доставку плазмидной ДНК в первые 48 ч. ко-инкубирования в непосредственном контакте с культурой клеток. Однако для реализации трансфекции в условиях in vitro требовалось наличие трансфицирующего агента. После подкожного введения разработанных ген-активированных гидрогелей мышам была выявлена и количественно оценена эффективность доставки генных конструкций с использованием прижизненного люминисцентного исследования (Ivis Spectrum), а также прямой визуализации генных конструкций, предварительно меченных Cy3. Изначально, вызвала удивление наиболее высокая эффективность трансфекции, выявленная в случаях изделий, показавших цитотоксичность при непосредственном контакте с культурами клеток. Однако в ходе гистологического исследования была идентифицирована причина такого результата – эти варианты гелей вызывали развитие воспаления. По итогам первого года работы были выбраны два наиболее перспективных прототипа ген-активированных гелей на основе гиалуроновой кислоты и коллагена, которые отличались оптимальной биосовместимостью и обеспечивали умеренный уровень пассивной доставки плазмидной ДНК в клетки in vivo. Оптимизация этих гидрогелей в ходе последующих этапов работы позволит усилить эффект генных конструкций, что может стать ключом к успешной стимуляции репаративной регенерации тканей опорно-двигательного аппарата и кожи.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проблема оптимизации репаративной регенерации поперечнополосатой скелетной мышечной ткани представляет большой фундаментальный интерес и является высоко актуальной для клинической практики. При объемных повреждениях скелетных мышц заживление происходит путем формирования соединительнотканного рубца. В связи с этим разрабатываются способы индукции репаративного миогенеза. Один из перспективных подходов в этой области связан с применением ген-активированных материалов, в частности, в виде гидрогелей. В ходе второго года реализации проекта были исследованы 2 варианта ген-активированных гидрогелей (на основе гиалуроновой кислоты и коллагена), выбранные по результатам работ первого года, а также разработаны еще 4 варианта ген-активированных гидрогелей на основе альгината натрия: 1 – гидрогель без дополнительных компонентов; 2 – альгинатный гидрогель с микрочастицами октакальциевого фосфата (ОКФ, для пролонгированной сшивки альгинатного гидрогеля и комплексообразования с молекулами плазмидной ДНК); 3 – альгинатный гидрогель с частицами сшитого альгината, несущими плазмидную ДНК; 4 – альгинатный гидрогель с частицами желатина, содержащими хлорид кальция (для пролонгированной сшивки альгинатного гидрогеля). На первом этапе были охарактеризованы биосовместимость гидрогелей на основе альгината и уровень доставки ими плазмидной ДНК в клетки in vivo в подкожном тесте на мышах в эксперименте с прижизненным биолюминисцентным исследованием с использованием маркерной плазмидной ДНК, несущей ген люциферазы. Было показано, что ген-активированные гидрогели способствовали поступлению плазмидной ДНК в клетки, при этом динамика трансфекции была более пролонгированная, чем в контроле с введением генной конструкции в водном растворе. В модели объемного дефекта скелетной мышцы у крысы (дефект передней большеберцовой мышцы протяженностью 10 мм и толщиной 2-3 мм) имплантированные ген-активированные гидрогели индуцировали репаративный рабдомиогенез с формированием MYH7B+-мышечных волокон в большем количестве, чем соответствующие гидрогели без плазмидной ДНК. Наибольший миогенный эффект показали варианты на основе гиалуроновой кислоты и альгината натрия с ОКФ, особенно на сроке 2 недели после операции. При этом первый в одном случае привел к образованию гетеротопического очага гиалиновой хрящевой ткани. Таким образом, разработанные гидрогели могут быть использованы для дальнейшей разработки медицинских изделий, показанных для лечения пациентов с повреждениями скелетных мышц. Варианты гидрогелей на основе гиалуроновой кислоты, альгината натрия с микрогранулами ОКФ и без них целесообразно исследовать в отношении оптимизации репаративной регенерации костной и хрящевой тканей, что запланировано на третьем году реализации проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Третий год реализации проекта был посвящен оценке влияния разработанных инъекционных ген-активированных материалов, содержащих плазмидную ДНК с геном сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), на регенерацию костной и хрящевых тканей. Были исследованы три варианта гидрогелей, изготовленных на основе альгината натрия, гиалуроновой кислоты и коллагена. В качестве дополнительного средства доставки плазмидной ДНК и остеокондуктивного компонента использовались микрогранулы октакальциевого фосфата. Исследуемые материалы были имплантированы в полнослойные билатеральные дефекты (диаметром 10 мм) теменных костей кроликов. Было выявлено, что плазмидная ДНК за счет ангиогенного эффекта усиливает формирование костной ткани, наделяет материал остеоиндуктивными свойствами, которые были особенно выражены в случае гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты. В модели дефекта суставного хряща (диаметр 3 мм, глубина 4 мм) было выявлено, что гидрогели на основе коллагена и гиалуроновой кислоты способы формировать не только фиброзный, но и гиалиновый хрящ. Как и в случае костного дефекта, наиболее эффективным оказался ген-активированный гидрогель на основе гиалуроновой кислоты. Дополнительно к запланированным работам была выполнена оценка влияния исследуемых гидрогелей на регенерацию эластического хряща ушной раковины. Оказалось, что плазмидная ДНК с геном VEGF, в составе всех вариантов гидрогелевых матриксов способствовала формированию хрящевой ткани со стороны стенок дефекта, тогда как в контрольных группа хондрогенез не наблюдался вовсе. В исследованиях in vitro, перенесенных со второго года проекта, была доказана способность гидрогелевых матриксов на основе гиалуроновой кислоты и коллагена усиливать доставки плазмидной ДНК в клетки линии HEK293. При этом эффективность доставки, оцененная по уровню мРНК трансгена и концентрации белка VEGF-A16, была выше, чем при использовании трансфицирующего агента Lipofectamine 3000. Таким образом, в ходе третьего года реализации проекта были получены убедительные данные об эффективности разработанных ген-активированных гидрогелей и выбран оптимальный кандидат в медицинское изделие для лечения пациентов с патологией костей и суставов. Выполнение дополнительных исследований, направленных на выявление наиболее эффективной дозы плазмидной ДНК в составе гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты, позволят перейти к прикладным исследованиям и трансляции результатов в клиническую практику.