Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Проведены эксперименты по установлению временного хода индукции автофагии в корнях проростков Arabidopsis thaliana экотипа Wassilewskija (Ws-0) и полученной в Ws-0 методом T-ДНК-инсерционного мутагенеза мутантной линии gork 1-1, содержащей нонсенс-мутацию в гене AT5G37500, кодирующем канал GORK (gated outwardly-rectifying K+ channel). Выявлены наиболее сильно индуцирующие автофагию концентрации NaCl и периоды максимумов образования автофагосом. Показано, что выраженная автофагия в клетках корня дикого типа индуцируется за 6-8 ч экспозиции в буфере, содержащем 50 mM NaCl, тогда как в клетках мутанта gork 1-1 накопление автофагосом наблюдается только через 10-12 ч солевого стресса. Этаблированы методы визуализации мертвых и живых клеток корня Arabidopsis thaliana в условиях солевого стресса с помощью нескольких специфичных флуоресцентных красителей (DAPI, диацетат флуоресцеина, пропидиум иодид). Проведена предварительная оценка уровня индукции клеточной смерти дикого типа и мутанта при солевом стрессе (100 mM NaCl, длительность экспозиции 2 ч). Изучена динамика роста корней проростков на фоне нескольких концентраций NaCl в фитагелезированной среде. Растительный материал собран, проводится выделение РНК для выявления точки активации экспрессии маркерного гена жасмонатного сигналинга при адаптации к солевому стрессу и исследование уровней экспрессии фитохромов А, В. 2. За отчетный период было проведено размножение семенного материала солеустойчивых сортов ячменя из коллекции генетических ресурсов растений ВИР. На основе полевого изучения образцов ячменя проведена оценка элементов продуктивности солеустойчивых сортов ячменя при выращивании в условиях Ленинградской области. Проведены серии экспериментов по оценке солеустойчивости растений ячменя Donaria и chlorina f2 3613 в гидропонной системе выращивания. Изучен рост проростков ячменя в условиях солевого стресса. Проведен скрининг используемых в проекте линий и сортов ячменя на солеустойчивость при выращивании на белом свету. Растительный материал собран, проводится выделение РНК для выявления точки активации экспрессии маркерного гена жасмонатного сигналинга JIP23 и исследования уровней экспрессии фитохромов А, В и С. Опробован метод ранней проростковой диагностики устойчивости к засолению и показана средняя степень солеустойчивости как у дикого типа Donaria (44-45%), так и мутанта chlorina f2 3613 (40-41%). Адаптирован метод оценки динамики флуоресценции хлорофилла с помощью ПАМ-флуориметрии, проведена оценка базовых параметров фотохимической активности фотосистемы II (F0, Fm, Fv/Fm) в листьях мутанта ячменя chlorina f2 3613 при выращивании в гидропонной культуре в условиях солевого стресса (150 мМ NaCl). 3. С использованием гидропонной системы выращивания начаты эксперименты по исследованию влияния дальнего красного света на развитие проростков ячменя в условиях солевого стресса (150 mM NaCl). Выявлено значительное подавление прорастания и торможение роста проклюнувшихся семян в условиях засоления. Собран листовой (отдельно колеоптили и настоящие первые листья), а также корневой материал для последующей экстракции РНК и оценки уровня экспрессии генов интереса. 4. Выполнено исследование активности TOR-киназы в ответ на солевой стресс в трансгенных линиях Arabidopsis thaliana со сверхэкспрессией белка SK6 (субстрата TOR-киназы), меченой тегами FLAG и НА. Растительный материал собран и находится в обработке. 5. Проведены эксперименты по стимуляции автофагии и визуализации автофагосом в клетках микроводоросли Haematococcus pluvialis. при добавлении тиомочевины, голодании культуры (на фоне исключении нитратов из среды) и под воздействием ионов тяжёлых металлов (Ni2+). Отработана методика визуализации автофагосом с помощью иммуномечения антителом к ассоциированному со зрелыми автофагосомами ATG-8 белку. 6. Запланированные на отчетный 2018 год исследования успешно выполнены. Получены экспериментальные данные и адаптирован комплекс методов, необходимых для решения задач проекта, запланированных на последующие этапы его выполнения.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках проекта продолжается изучение взаимосвязи ключевых регуляторных событий, имеющих место при ряде стрессовых воздействий –потери калия, опосредованной наружу-выпрямляющими каналами плазмалеммы GORK, индукции автофагии и запрограммированной клеточной гибели (ЗКГ), активации жасмонат-зависимых генов стрессового ответа, и изменений роста и морфогенеза. Работы проводятся на модели солевого стресса как наиболее изученной и актуальной с практической точки зрения, на двух модельных объектах – ячмене и Arabidopsis thaliana. Целью исследований является поиск механизмов направленной регуляции баланса между программами роста и защиты от стрессов с целью одновременного повышения продуктивности и устойчивости ячменя. В 2019 году достигнуты все важнейшие результаты, запланированные на данный этап, и получен ряд дополнительных данных, позволяющих уточнить дальнейшее научное направление развития проекта, и одновременно расширить сферу потенциальной значимости его результатов. К наиболее важным результатам за отчетный период относится, во-первых, выяснение механизмов активации автофагии дефицитом уровня калия в клетке. Впервые для эукариотических организмов показана активация атвофагии при дефиците калия, выяснена роль киназ TOR и ортолога АМРК - SnRK1 – в этом процессе, показано влияние дефицита калия на энергетический метаболизм клетки, установлена причина образования обнаруженных нами характерных для дефицита калия скоплений автофагосом: показано, что они вызваны нарушениями микротрубочкового цитоскелета. Эти результаты создают новый уровень понимания проблемы устойчивости к солевому стрессу, так как в растительной клетке солеустойчивость напрямую связана со способностью удерживать внутриклеточный калий. Во-вторых, важнейшим результатом проекта является создание удобной модели для исследования регуляции автофагии у ячменя – получение трансгенных растений ячменя, экспрессирующих конструкт-сшивку NeonGreen-ATG8a. Ниже перечислены основные выполненные в 2019 году экспериментальные работы с указанием достигнутых результатов. (1). Установлены временной ход индукции автофагии и развития запрограммированной клеточной гибели (ЗКГ) при солевом стрессе, а также выявлены роли экспрессии маркерных генов жасмонатного сигналинга и фитохромов А и В, у ячменя для сортов с различной солеустойчивостью. Показано, что даже при концентрации 300 мМ NaCl в корнях ячменя погибают только отдельные клетки, при этом их гибель идет по некротическому, а не по вакуолярному, типу. Продемонстрировано, что мутантная линия ячменя сlo-f2 3613 со снижением экспрессии фитохромов А и В обладает высокой солеустойчивостью, и превосходит родительским сортом Donaria. Показано, что установленная ранее индукция жасмонатного сигналинга при солевом стрессе может быть вызвана в первую очередь потерей клетками корня калия в результате солевого стресса, и лишь во вторую очередь входом и влиянием на клетки ионов Na. Сделан вывод, что охарактеризованные у арабидопсиса пути регуляции ростовых и стрессовых ответов при солевом стрессе функционируют и регулируются у ячменя по сходным принципам. (2) Исследована динамика роста корней ячменя при засолении 150 мМ NaCl на фоне двух уровней К+ и Ca2+, а также при добавлении блокатора К+-каналов – тетраэтиламмония (ТЕА). Изучены морфометрические параметры корней и листьев, осмоляльность клеток, содержание К и Na, а также нефотохимическое тушение флуоресценции OJIP-кинетики. Обнаружено появление негативных К-полос в индукционных кривых OJIP, предположительно специфичных для ингибирования активности калиевых каналов. (3). Исследована устьичная регуляция в нокаутных линиях арабидопсиса gork 1-1 при солевом стрессе. Сделан вывод, что в целом мутация gork снижает устойчивость растений к солевому стрессу из-за нарушений устьичной регуляции, хотя и оказывает некоторое позитивное влияние из-за снижения токсичности ионов Na, что может быть вызвано улучшением задержки калия в клетках мутанта. (4) Проверена гипотеза об участии элементов цитоскелета в быстрой активации автофагии при солевом стрессе на линиях Arabidopsis thaliana с меченым GFP-fABD2 актиновым цитоскелетом, а также в мутантах mor1 с дефектами микротрубочек. Сделан вывод, что микротрубочки, но не микрофиламенты, участвуют в активации автофагии при солевом стрессе у арабидопсиса, и, кроме обеспечения транспорта, важны для слияния автофагосом с лизосомами и литическими компартментами. (5). Изучено влияния недостатка калия на активацию автофагии. Впервые показано, что дефицит калия в среде роста и вызванное этим снижение клеточного калия вызывают опосредованное SnRK1-киназой ингибирование TOR, активацию автофагии, образование агрегатов автофагосом, а также защелачивание апопласта и вакуолей и вследствие этого остановку автофагии на стадии лизиса в вакуоли. (6) этаблирован метод трансформации каллусов ячменя сорта Golden Promise и регенерирования трансгенных растений. Получены трансгенные растения ячменя, образующие меченые флуоресцентным тегом NeonGreen автофагосомы. (7) Исследовано: влияние автофагии на выживаемость клеток Haematococcus pluvialis и накопление каротиноидов в условиях солевого стресса и естественного истощения культуры. Показано, что у гематококка при солевом стрессе автофагия выполняет цитопротекторную роль и улучшает выживаемость клеток, и при этом несущественно сказывается на накоплении каротиноидов; что повышало выход каротиноидов из культуры гематококка за счет снижения смертности клеток. По результатам этапов 2018-2019 гг. подготовлена к отправке в журнал Journal of Applied Phycology (Q1) рукопись 1 публикации, и отправлены в журнал рукописи 3 публикаций, из них одна находится на стадии major revisions в журнале Photosynthetica (Q2), и две на стадии under review в журналах Autophagy (Q1) и Экологическая генетика (Q4).

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект посвящен выявлению взаимосвязи ключевых регуляторных событий, имеющих место при ряде стрессовых воздействий - потери клетками калия, индукции автофагии и программированной клеточной смерти (ПКС), активации жасмонат-зависимых генов стрессового ответа, изменений роста и морфогенеза – у важной сельскохозяйственной культуры ячменя, с использованием данных, полученных для модельного растения Arabidopsis thaliana как наиболее изученного в данном аспекте. В проекте используется модель солевого стресса как наиболее изученная для ячменя и актуальная для практики. Кроме того, в проекте также изучается другая перспективная с практической точки зрения модель – зеленая микроводоросль Haematococcus pluvialis, где солевой стресс используется для промышленного получения ценного каротиноида астаксантина, но вызывает сильную гибель клеток. У эукариотических организмов программы роста и морфогенеза контролируются киназным комплексом TOR, а программы, отвечающие за остановку роста и другие стрессовые реакции, контролируются киназой АМРК или ее ортологами (SnRK1 у растений). Эти же киназы регулируют и автофагию. Полученные в отчетном году результаты показывают, что путь к направленной регуляции баланса между программами роста и защиты от стрессов с целью одновременного повышения продуктивности и устойчивости растений лежит через выявление регуляторов TOR и SnRK1. В 2020 году достигнуты все важнейшие запланированные результаты, и получен ряд дополнительных данных, позволяющих уточнить дальнейшее направление научного развития проекта, и расширить сферу потенциальной значимости его результатов. К наиболее важным результатам следует отнести, во-первых, проведение успешной агробактериальной трансформации и регенерации линий ячменя с различной солеустойчивостью: сорта Donaria и двух мутантов аллельной серии chlorina f2 clo f2 3613 и clo f2; сорта Tron и мутанта серии chlorina f2 clo f2.105; сорта К-23682 Донецкий-8. Расширение списка трансформируемых сортов ячменя, включая современные перспективные сорта, с целью их последующего геномного редактирования, является важнейшей задачей, и в рамках проекта в отчетном году были сделаны шаги в данном направлении. Во-вторых, получена новая информация о механизмах, опосредующих устойчивость к солевому стрессу у зеленой микроводоросли Haematococcus pluvialis. Эта водоросль является источником ценного каротиноида астаксантина, но его промышленное получение (где солевой стресс используется как индуктор астаксантина) затруднено из-за высокой смертности клеток при засолении. Полученные результаты открывают новые пути для поиска факторов, способных улучшить выживаемость клеток и выход астаксантина. В-третьих, построена гипотетическая схема иерархических взаимоотношений фитохромного и жасмонатного сигналинга, и их влияния на баланс регулярного модуля TOR-SnRK1 для арабидопсиса и ячменя. Эта схема поможет в выяснении дальнейших возможностей получения сортов и генотипов культурных растений с одновременным повышением устойчивости к стрессам и хорошим ростом в условиях стресса, В четвертых, с применением комплекса новых методов получены доказательства, подтверждающие результаты предыдущего этапа исследований, а именно, что дефицит калия в растительной клетке ингибирует киназу TOR посредством активации киназы SnRK1 в связи с влиянием на энергетический метаболизм клетки; что характерные при дефиците калия скопления автофагосом вызваны нарушениями микротрубочкового цитоскелета; что хронический дефицит калия, в отличие от острой потери калия при солевом стрессе, не вызывает индукции ПКС. Эти результаты создают новый уровень понимания проблемы устойчивости к солевому стрессу, так как в растительной клетке солеустойчивость напрямую связана со способностью удерживать внутриклеточный калий. Ниже перечислены основные выполненные в 2020 году экспериментальные работы с указанием достигнутых результатов. (1). Успешно трансформированы вектором LIIBR3-4-pUBI-NeonGreen-GATEWAY-BASTA, несущим кодирующую последовательность гена ATG8-белка в сшивке с флуоресцентным маркерным белком NeonGreen, линии ячменя с различной солеустойчивостью: 1) сорт Donaria и двух мутантов clo f2.3613 и clo f2.2800, ранее охарактеризованных нами как среднесолеустойчивые; 2) сорт Tron и мутанта clo f2.105 (среднесолеустойчивые); 3) сорт К-23682 Донецкий-8 (ранее охарактеризован нами как высокосолеустойчивый); 4) сорт Golden Promise (ранее охарактеризован в литературе как относительно солеустойчивый). Полученные трансгенные каллусные культуры и регенеранты культивируются в климатической камере Panasonic MLR-352H PHCB и находятся в стадии формирования листьев и молодых растений. Кроме того, ведется размножение полученных в 2019 г. регенерированных растений = ячменя сорта Golden Promise, трансформированных ранее тем же вектором. (2) Исследовано, возможна ли передача стрессового сигнала от корней к побегам при солевом стрессе у ячменя, и какую роль играют в этом процессе системы трансмембранного переноса калия в клетках корня, с помощью оригинального методического подхода мониторинга изменений электронного транспорта в фотосистеме 2 (ФС2) в ответ на подачу к корням стрессоров. Показано, что сигнал, передаваемый от корней к побегам при воздействии NaCl, является быстрым, не связан с осмотическими изменениями, и может быть зарегистрирован уже в течение часа после начала обработки корней стрессирующим фактором, однако блокирование трансмембранных потоков калия не влияет на быстрый NaCl-зависимый сигнал. (3) Были повторены исследования Haematococcus pluvialis с помощью трансмиссионной электронной микроскопии и исследования динамики автофагосом при солевом стрессе с помощью иммунофлуоресценции с использованием антител к белку CrATG8 Chlamydomonas reinhardtii; изучена динамика внутриклеточных ионов K и Na при солевом стрессе, а также изучен рост клеток и содержание ионов после адаптации культуры к повышенному содержанию кальция в среде выращивания. Результаты убедительно показали, что добавление к клеткам Haematococcus низкой концентрации ингибитора TOR-киназы AZD8055 стимулирует автофагию и улучшает рост клеток на умеренном солевом стрессе. Вторым потенциально важным с практической точки зрения результатом стал вывод о том, что высокая смертность клеток Haematococcus при сильном солевом стрессе протекает по типу вакуолярной клеточной гибели (в то время как у высших растений солевой стресс как правило вызывает некротическую клеточную гибель), но регулируется независимо от стресс-индуцируемой в этих клетках автофагии, которая выполняет цитопротекторную роль. (4) Доработаны методы экстракции, испробованы несколько новых антител (производства Abcam, Agrisera, Cell Signalling), и проведен количественный иммуноблоттинг для оценки уровней активности TOR-киназы с помощью iBright FL1500 Imaging System (ThermoFisher). Подтвержден сделанный ранее вывод об ингибировании активности TOR-киназы (оценивавшейся по уровню специфично фосфорилированной по Thr-449 формы белка-субстрата TOR S6K) в проростках, выращенных на дефиците калия, и о снятии данного ингибирования при добавлении активатора TOR – глюкозы. (5) Изучено влияние дефицита калия на уровни экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза, цикла Кребса и ассимиляции нитрата. Результаты выявили тенденцию к снижению экспрессии генов фумаразы и НАДФ-зависимого малик-энзима цитоплазмы, а также глутаминсинтетазы и глутаматдегидрогеназы митохондрий, что показывает, что снижение уровня цитоплазматического калия в первую очередь влияет на активности соответствующих ферментов, а не на экспрессии генов, и соответствует литературным данным. (6) Исследовано влияния дефицита калия на жизнеспособность клеток корней и на возможный запуск программированной клеточной гибели с применением окраски витальными красителями и с помощью TUNEL. Полученные данные весьма убедительно демонстрируют, что, в отличие от кратковременной острой потери калия клетками (Remillard et al., 2004; Demidchik et al., 2010), хронический дефицит калия не запускает программы клеточной гибели. (7) Изучено влияние ингибиторов цитоскелета при кратковременном 1 ч солевом стрессе на образование аггрегатов автофагосом; показано, что в присутствии ингибиторов (де)полимеризации микротрубочек оризалина и колхицина происходит формирование агрегатов автофагосом, что указывает на возможное участие калия в процессах организации микротрубочек, и подтверждают роль микротрубочек в транспорте автофагосом в клетках растений. (8). Сконструирован вектор, где имеется возможность клонирования промоторов для выявления локализации их экспрессии в тканях растений путем визуализации ядерной локализации белка NeonGreen, с маркерной устойчивостью к метотрексату. По результатам этапа 2020 г. находится на рецензии статья в журнале Q1 (WoS, Scopus) Zharova, D.A., Ivanova A. N., Drozdova I.V., Belyaeva A.I., Boldina O.N., Voitsekhovskaja O.V., Tyutereva E.V. «AZD8055, an inhibitor of TOR kinase, reveals a role of autophagy in Haematococcus pluvialis cell growth under salinity». Plants, under review; прошла первый цикл рецензирования статья в журнале Q1 (WoS, Scopus) Tyutereva E.V., Murtuzova A.V., Rabadanova C.K., Dobryakova K.S., Voitsekhovskaja O.V.. «Potassium deficiency inhibits TOR via SnRK1 in Arabidopsis thaliana, leading to aggregation of autophagosomes and alkalinization of lytic vacuoles». Autophagy, under review. принята к печати статья в журнале Q1 (WoS, Scimago) Klionsky D.,… Tyutereva E.V., … Voitsekhovskaja O.V.… et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy, 2021.