Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Данный проект (Проект 2018) является естественным и логичным продолжением проекта, выполнявшегося в 2015-2917 гг. (Проект 2015), отчет по которому доступен на сайте РНФ. План работы на 2018 г. состоял из 10 взаимосвязанных разделов (результаты по пятому разделу обсуждаются перед четвертым). 1. Собраны и проанализированы на основе индивидуальных данных по 2750 заболевшим эпидемиологические особенности иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) в 2011-2017 гг. в Архангельской, Кемеровской, Курганской, Ростовской и Смоленской областях, Алтайском и Приморском крае. Доля ИКБ в безэритемной форме среди всех случаев ИКБ варьировала от 30% до 45%. Серологическое изучение 208 образцов от 104 пациентов с клещевыми инфекциями в Республике Башкирия выявило 12 острых заболеваний ИКБ, вызванного B. miyamotoi (ИКБ-БМ) и три случая инфекции B. miyamotoi, перенесенной ранее; среди 84 пациентов в Вологодской области обнаружено 12 острых ИКБ-БМ, 2 человека перенесли инфекцию B. miyamotoi ранее. В результате серологического изучения 110 образцов от 51 пациента с клещевой инфекцией в 2017 г. в Новосибирской области выявлено 17 случаев острого ИКБ-БМ; у двух больных обнаружены анамнестические IgG антитела к B. miyamotoi. Новосибирские коллеги подтвердили с помощью ПЦР диагноз ИКБ-БМ у 14 из 17 больных и дополнительно обнаружили еще 3 серонегативных случаев ИКБ-БМ. Серологическое изучение 282 лиц после присасывания клеща в Нидерландах и 202 лиц - в Швеции выявило 17 и 11 острых заболеваний ИКБ-БМ, а также 7 и 9 случаев инфекции B. miyamotoi, перенесенных ранее, соответственно. Итак, практически во всех регионах Евразии, исследованных в 2018 г. и в ходе Проекта 2015, выявляются многочисленные острые случаи ИКБ-БМ и анамнестические антитела, свидетельствующие об инфекции, перенесенной ранее. 2. В результате углубленного исследования образцов крови, собранных в Екатеринбурге, в 2017 г. лабораторно подтверждены 51 случай инфекции B. miyamotoi и диагностированы 32 случая болезни Лайма, в 2018 г. 25 случаев ИКБ-БМ и шесть - болезни Лайма. В Красноярске лабораторно подтверждены семь случаев ИКБ-БМ. Результаты лабораторной диагностики и данные расширенного клинико-эпидемиологического исследования внесены в соответствующие базы данных, ведущиеся с 2009 г., в том числе в рамках Проекта-2015. Окончательный анализ этих баз будет проведен после завершения набора материала в 2019 г. 3. В рамках задачи по совершенствованию лабораторных возможностей диагностики ИКБ-БМ, расширенный вариант иммуночипа «нового поколения» для выявления антител к 22 антигенам B. miyamotoi и/или B. burgdorferi sensu lato был создан и испытан, используя 337 образцов сыворотки крови от 122 российских больных с ИКБ-БМ, подтвержденным ПЦР, и контрольные группы: 132 образца от 71 голландского пациента с культурально подтвержденной болезнью Лайма; 180, 101 и 100 образцов сыворотки от российских, шведских и норвежских здоровых доноров, соответственно. Заключение «антитела к B. miyamotoi в образце присутствуют» определяется по следующему алгоритму: «наличие антител к GlpQ И (наличие антител, как минимум, к одному их вариабельных основных белков наружной мембраны (Variable major proteins – Vmps) ИЛИ флагеллину (Fla = p41))». При использовании этого правила достигается 99%-100% специфичность и чувствительность от 60 до 80% как для IgM, так и IgG антительного ответа на инфекцию B. miyamotoi. В РФ 03-06-2018 зарегистрировано разработанное и испытанное нами медицинское изделие «Набор реагентов для диагностики in vitro АмплиСенс® Borrelia miyamotoi-FL», производства ЦНИИ Эпидемиологии. С практической стороны это означает, что теперь в лечебных учреждениях диагноз «ИКБ, вызванный B. miyamotoi» может официально ставиться на основании результатов, полученных с помощью этого набора. 5. Были высеяны в среду MKP-FS по разработанной ранее методике (см. Проект 2015) образцы крови от всех больных с ПЦР-подтвержденным ИКБ-БМ в Екатеринбурге и в Красноярске. В Екатеринбурге удалось высеять и закрепить в культуре шесть новых клинических штаммов B. miyamotoi. В Красноярске было посеяно 6 образцов от больных с ИКБ-БМ; устойчивого роста B. miyamotoi не было получено. 4. Изучается геном этих шести штаммов, а также двух штаммов B. miyamotoi, выделенных нашими соавторами в Голландии от клещей Ixodes ricinus (впервые). Собраны и аннотированы хромосомы, показано, что российские штаммы принадлежат к «азиатскому», а голландские – к «европейскому» генотипу, определены аллели локусов, используемых для мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) и последовательности экспрессируемых генов белков Vmps, разделяемых на два семейства – Variable small proteins (Vsp) и Variable large proteins (Vlp), которое в свою очередь разделяется на три подсемейства – Vlp-Delta, Vlp-Gamma и Vlp-Alpha (Vlp-D, Vlp-G и Vlp-A). Полный геном одного из штаммов (Izh-4), выделенных в 2016 г. был секвенирован на «референтной» платформе PacBio. Сопоставление результатов, полученных на платформах MinION и PacBio, позволило установить «финальный» плазмидный профиль штамма Izh-4, состоящий из 12 линейных и 3 кольцевых плазмид, для идентификации которых была разработана уникальная методика на основе выявления генов белков, участвующих в репликации плазмид (паралогов PFam32, PFam49, PFam50 и PFam57-62). 6. Набор реагентов для выявления экспрессируемых генов Vmp методом ПЦР в реальном времени дополнен праймерами и пробами для выявления экспрессируемых генов Vlp-A. Экспрессия Vlp-A обнаружена в 10% образцов ДНК B. miyamotoi из крови больных ИКБ-БМ и в 13% образцов ДНК B. miyamotoi из иксодовых клещей. Расширенные исследования согласно пункту плана 7 не выявили необходимость оптимизации разработанной нами схемы МЛСТ. 7. Из 113 образцов ДНК B. miyamotoi из крови больных ИКБ-БМ и 110 образцов ДНК B. miyamotoi из иксодовых клещей экспрессия Vlp-D выявлена в 60% и 37%, Vsp в 43% и 25%, Vlp-G в 7% и 8%, Vlp-A в 4% и 6%, соответственно. Только 10% образцов из крови больных и 26% образцов клещей были отрицательны в мультиплексной ПЦР, выявляющей экспрессированные Vmp. В ряде образцов обнаружена экспрессия двух типов Vmp. Так, 20% образцов из крови больных, но только 1% образцов из клещей содержат свидетельства «двойной экспрессии» Vlp-D и Vsp (p = 0.000002). Другие комбинации ко-экспрессирующихся генов встречаются в единичных случаях. МЛСТ позволяет дифференцировать 11 сиквенс-типов (СТ) B. miyamotoi, переносимых клещами I. persulcatus, а также отдельные СТ, присущие штаммам B. miyamotoi, переносимым клещами видов I. ricinus, I. scapularis или I. pacificus. Наиболее распространен в России СТ-1, обнаруженный у штаммов Izh-16 и Yek-1, а также у 50% и 22% ДНК-изолятов B. miyamotoi из крови и клещей, соответственно. 8. К косвенным признакам реализации механизма «иммунного избегания» можно отнести выявление в крови больного ИКБ-БМ ДНК двух или более экспрессируемых генов Vmp (встречается у 23% изученных больных, см. п. 7). При этом прочие генетические характеристики изолятов полностью идентичны, то есть речь не идет о заражении двумя разными штаммами, но именно о последствиях замены у части бактерий, присутствующих в крови, экспрессированного на плазмиде lp41 гена Vmp. Характерно, что в клещах-переносчиках присутствие ДНК двух или более экспрессируемых генов Vmp крайне редко и, судя по всему, не нужно для персистенции боррелий в клеще. Другой косвенный признак - выявление продукции антител к разным антигенным вариантам Vmp – Vlp и Vsp (встречается приблизительно у 25% изученных больных). С учетом данных об экспрессии Vmp можно предположить, что антитела вырабатываются не только к геноварианту Vmp, экспрессирующемуся в крови, взятой в момент госпитализации, но и к иному варианту, присутствовавшему на догоспитальной стадии, но затем элиминированному. При заражении полевок этот эффект нагляднее – у некоторых животных обнаруживаются антитела к варианту Vmp, который не экспрессировался штаммом в момент заражения. Наконец, опыты на полевках (см. п. 10) прямо доказывают возможность переключения экспрессии Vmp. С помощью ПЦР-методик обнаружены случаи переключения Vlp-D -> Vsp, Vsp -> Vlp-D, Vlp-G -> Vsp, Vlp-G -> Vlp-D, и даже двойное переключение Vlp-D -> Vsp -> Vlp-G. Новый геновариант появляется в среднем на 8-13 день после заражения, что часто совпадает с первым или вторым пиком спирохетемии. 9. Показано, что ко-инкубация с B. miyamotoi не меняет характеристики спонтанной или активированной АДФ агрегации тромбоцитов или активации тромбоцитов в цельной крови, оцениваемые по экспрессии гликопротеина Ib, интегрина αIIbβ3, P-селектина альфа-гранул, и по морфологии тромбоцитов. Образование сгустка в свободной от тромбоцитов плазме крови здоровых доноров (тромбодинамический тест) не отличалось в контрольных (без взаимодействия с B. miyamotoi) или экспериментальных условиях по таким параметрам, как скорость роста и плотность сгустка, если тест проводился в присутствии ингибитора контактного пути свертывания. В отсутствии ингибитора после пре-инкубации с B. miyamotoi сгусток образовывался быстрее и был плотнее. Предположительно, B. miyamotoi способствует активации контактного пути свертывания, что может быть лабораторным коррелятом сокращения АЧТВ и микроциркуляторных нарушений, наблюдаемых приблизительно в половине клинических заболеваний ИКБ-БМ. 10. После подкожного заражения полевок Myodes rutilus или M. glareoulus (21 животное) клиническим штаммом Izh-4, экспрессирующим Vlp-D, максимальный уровень спирохетемии (в среднем 1000000 спирохет на мл) регистрировался на 8-й день. В среднем к 16 дню боррелии исчезают из крови, в которой у 100% полевок обнаруживаются антитела к Vlp-D, а у 24% полевок - и антитела к Vsp. Через три месяца после первичного заражения животным была введена доза либо того же самого штамма Izh-4 (пять полевок), либо штамма Izh-14 (пять полевок), экспрессирующего иной тип Vmp, а именно Vlp-G. В течение 15 дней последующего наблюдения B. miyamotoi не обнаруживалась в крови ни у одной полевки. Наконец, были изучены полевки M. rutilus, спонтанно заразившиеся в природных условиях B. burgdorferi sensu lato (5 животных) или Anaplasma phagocytophilum (5 животных) и хронически инфицированные на момент лабораторного заражения штаммом Izh-4 или штаммом Izh-14. Зараженность анаплазмой или возбудителями болезни Лайма значимо не влияла на уровень и длительность спирохетемии B. miyamotoi. Таким образом, полевки Myodes могут быть использованы в качестве лабораторной модели инфекции B. miyamotoi и, возможно, участвуют в циркуляции возбудителя в природных очагах. Однако сравнительно короткий период спирохетемии указывает на то, что холодное время года возбудитель, вероятно, перезимовывает в клещах, находящихся в состоянии диапаузы. Все запланированные в отчетном году исследования выполнены и результаты достигнуты.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Работы в 2019 проводились согласно плану, состоящему из 10-ти разделов. 1. Серологическими методами с использованием разработанного нами планарного белкового микрочипа исследована большая коллекция сывороток (более 3350 образцов), предоставленная нашими коллегами из Нидерландов. Показано, что IgM и IgG антитела к B. miyamotoi встречаются у 1.4% и 1.2% голландских доноров, соответственно. В большинстве случаев эти антитела указывают на ранее перенесенную инфекцию, но возможны и бессимптомные случаи острой инфекции B. miyamotoi в момент забора крови. Среди лиц с диагнозом «болезнь Лайма» у 5.4% обнаружены IgM антитела к B. miyamotoi, у 2.8% - обнаружены IgG антитела. Детальный анализ этих данных показывает, что 3.4% пациентов имели острую (ко)инфекцию B. miyamotoi и B. burgdorferi sl, еще 1.1% - анамнестические антитела к B. miyamotoi. Среди лиц, почувствовавших себя больными после присасывания иксодового клеща в Нидерландах, но не имевших мигрирующей эритемы (признак болезни Лайма), 18% пациентов можно поставить диагноз "острый иксодовый клещевой боррелиоз, вызванный B. miyamotoi" (ИКБ-БМ). 2. При исследовании 160 проб от 73 лиц с подозрением на клещевые инфекции в Новосибирске в 2018 г. серологически выявлено 28 случаев ИКБ-БМ, 20 из них подтверждены ПЦР. У 4 лиц обнаружены анамнестические IgG антитела, указывающие на ранее перенесенную инфекцию B. miyamotoi. При исследовании 103 проб от 67 больных из Челябинска четыре случая ИКБ-БМ подтверждены ПЦР и еще 4 случая – серологически. 3. В состав текущего (улучшенного) варианта планарного белкового иммуночипа для выявления антител к антигенам боррелий дополнительно включены еще три варианта Vmp (Variable major proteins) из семейства Vsp (Variable small protein), белок BBK32 («фибронектин-связывающий белок»), белок p39 (BmpA – «основной мембранный белок А») и белок CbiA («связывающий и ингибирующий комплемент белок»). В результате иммуночип включает 12 антигенов B. miyamotoi и 14 B. burgdorferi sensu lato. При использовании этого иммуночипа сохраняется 99%-100% специфичность, а чувствительность достигает 70-90% как для IgM, так и IgG антительного ответа на инфекцию B. miyamotoi. 4. В 2019 завершена потребовавшая больших усилий «референсная» сборка полного генома штамма Izh-4, состоящего из хромосомы, 12 линейных и трех кольцевых плазмид, на основе результатов, полученных с помощью оптимизированной технологии «коротких прочтений» (на платформе Illumina) и двух технологий «длинных прочтений» (Pacific Bioscience single-molecule real-time technology and Oxford Nanopore technology). Результаты депонированы в GenBank и NCBI Sequence Read Archive. При детальном анализе последовательностей «архивных плазмид» найден ген пятого варианта Vmp, Vlp-Beta. (Ранее считалось, что B. miyamotoi имеет только гены семейства Variable small proteins (Vsp) и гены семейства Variable large proteins (Vlp) в трёх антигенных вариантах (подсемействах) Vlp-Delta (VlpD), Vlp-Gamma (VlpG) и Vlp-alpha (VlpA)). Шесть Екатеринбургских и один Красноярский штамм секвенированы на платформе Illumina и на платформе MinION (Oxford Nanopore technology). На основе первичных данных секвенирования на платформе Illumina, предоставленных голландскими коллегами, собраны и проанализированы геномы (хромосома и три плазмиды, включая «плазмиду вирулентности» lp41) двух штаммов B. miyamotoi, выделенных нашими соавторами в Нидерландах. Собранные и аннотированные нуклеотидные последовательности выложены в GenBank. 5. Выделена чистая культура B. miyamotoi от больного ИКБ-БМ в Красноярске (впервые в этой половине Земного шара). Пять штаммов, выделенных в 2018 гг. в Екатеринбурге, и штамм, выделенный в Красноярске в 2019, депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов, г. Оболенск. 6. Проводимое в 2020 г. типирование образцов ДНК B. miyamotoi методом мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) подтвердило вывод 2019 г.: разработанная нами схема МЛСТ функциональна, информативна и пока не требует модификаций. Дополнительно к уже созданным в 2017-2018 гг. ПЦР-методикам выявления экспрессируемых генов Vmp были разработаны, испытаны и практически применены методики амплификации и секвенирования «длинных фрагментов» генов Vmp, кодирующих более 80% белковой последовательности, что позволило повысить достоверность и информативность описания многообразия вариантов B. miyamotoi, встречающихся в природе. В частности, у европейских штаммов и небольшой части российских изолятов были выявлены существенные мутации, потребовавшие использования дополнительных праймеров и зондов. Обнаружение в геноме VlpB (см. п. 4), потребовало включения в типирующую схему праймеров и к этому варианту. На настоящий момент экспресс-типирование проводится с помощью четырех смесей для мультиплексной ПЦР-РРВ. В первую смесь включен прямой праймер, комплементарный «азиатским/американским» вариантам бактериального промотора и обратные праймеры и зонды, специфические по отношению к Vsp, VlpD и VlpG. Вторая смесь включает тот же прямой праймер, и обратные праймеры и зонды, специфические по отношению к VlpA и VlpB. 3-я и 4-я смесь отличаются от 1-й и 2-й смеси, соответственно, только тем, что они содержат прямой праймер, комплементарный «европейскому» варианту бактериального промотора. Во всех смесях присутствуют контрольные праймеры и зонд, специфические для гена GlpQ B. miyamotoi. Критически важно, что с помощью этих методик окончательно подтверждено наличие явления «иммунного избегания» при экспериментальном заражении полевок B. miyamotoi (см. п. 8 и 10) 7. Продолжено изучение многообразия вариантов B. miyamotoi, встречающихся в природе, используя для этого все доступные образцы ДНК B. miyamotoi, в частности, от больных ИКБ-БМ из Новосибирска, Челябинска и Красноярска, а также образцы из клещей I. ricinus, предоставленных чешскими, голландскими, бельгийскими и английскими коллегами, что позволило достовернее рассмотреть связи определенных геновариантов B. miyamotoi с приспособлением к организму определенного хозяина и с клиническими проявлениями ИКБ-БМ, вызываемого данным геновариантом. 9. Проведено исследование влияния B. miyamotoi на образование сгустка крови в модели, когда цельная кровь прокачивается через искусственный микрокапилляр, имитирующий естественный. Показано, что при добавлении B. miyamotoi более чем в два раза увеличивается площадь, занимаемая тромбами, а также увеличивается доля «сверхактивированных» тромбоцитов. На поверхность микрокапилляра оседает в два раза больше гранулоцитов, при этом они более подвижны и реже имеют признаки апоптоза по сравнению с гранулоцитами в контрольных условиях (без боррелий). Методом проточной цитофлуорометрии показано, что добавление боррелий приводит к активации нейтрофилов (регистрируемой по экспрессии CD11). При использовании спектрофотометрического метода регистрации подтверждено влияние B. miyamotoi на скорость «внутреннего» (контактно активируемого) пути свертывания в свободной от тромбоцитов плазме. 10. Проведено подкожное заражение полевок Myodes rutilus и беспородных белых мышей низкими дозами штамма Izh-14 (от 100000 до 1000 живых спирохет), имитирующее условия заражения в природе. Показано, что максимальная концентрация боррелий в крови (порядка 100000 на мл) достигается на 9-16 день после заражения дозой 100000 и достигается на 14-23 день после заражении дозой 1000 (порядка 1000 на мл). К 37 дню боррелии элиминируются из крови, хотя ДНК B. miyamotoi была обнаружена в мозгу и печени одной полевки через 60 дней после заражения. В рамках энтомологических экспериментов было осуществлено прокормление личинок клещей I. persulcatus, I. pavlovskyi и I. apronophorus на мышах, зараженных B. miyamotoi; показано, что от 50% до 100% личинок становятся инфицированными. Образовавшиеся из этих личинок нимфы оказываются зараженными в 25-70% случаев, то есть, показана трансстадиальная передача возбудителя. 8. Ключевой проблемой патогенеза инфекции B. miyamotoi является реальное (экспрессируемое) многообразие Vmp и потенциальное (присутствующее в геноме, на плазмидах) многообразие «молчащих» генов Vmp, на которые может быть переключена экспрессия Vmp в ходе реализации механизма «иммунного избегания». В клинических условиях (см. п. 2 и 7) у 25% больных ИКБ-БМ обнаруживается ДНК двух или более экспрессируемых генов Vmp в крови. Более того, около 50% больных производят антитела к антигенному варианту Vmp, который отсутствовал в крови в момент выявления ДНК B. miyamotoi. Это косвенные признаки наличия «иммунного избегания». В опытах на грызунах (см. п. 10) показано, что в крови животных, которым ввели штамм, экспрессирующий VlpG, на 6-20 день после заражения обнаруживаются популяции спирохет, экспрессирующих Vsp или VlpD (с различными аминокислотными последовательностями) и даже VlpB. При этом грызуны продуцируют антитела не только к VlpG, но и, в большинстве случаев, к антигенам VlpD и/или Vsp, и/или VlpA. Это прямое доказательство наличия «иммунного избегания» (Файл 1.6, рис. 12). Именно механизм «иммунного избегания», реализуемый B. miyamotoi в процессе колонизации организма человека, приводит к тому, что B. miyamotoi, как и другие боррелии группы возвратных лихорадок, в отсутствии антибиотикотерапии способны вызывать несколько рецидивов лихорадки, разделенных 1-2 неделями относительно хорошего самочувствия больного. На момент сдачи отчета в 2019 г. вышли четыре публикации в международных журналах, индексируемых в базах данных Web of Science Core Collection или Scopus, и 11 публикаций, индексируемых только в РИНЦ. Таким образом, обязательства по количеству публикаций в 2018-2019 гг. перевыполнены. Сделано 15 докладов, из них 7 устных докладов на международных научных мероприятиях. Все запланированные на 2019 г. (и суммарно на 2018-2019 гг.) научно-исследовательские работы выполнены и ожидаемые результаты достигнуты.