Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году в рамках проекта велась разработка статистических методов для анализа роли длинных некодирующих РНК в формировании профиля хроматина клетки, а также программных конвейеров, инкорпорирующих эти методы. В первую очередь нами разработана вероятностная модель взаимодействия РНК и ДНК с формированием триплексов по правилам Хугстина. Базовым алгоритмом для предсказания взаимодействия РНК и ДНК с образованием триплексов, который используется в этой работе, является алгоритм, реализованный в программе Triplexator. В нашей текущей работе этот алгоритм был существенно доработан. Разработана вероятностная модель распределения численной величины (скора), которую определяет исходный алгоритм и которая отражает количество спаренных оснований. Данная модель позволяет учитывать длины взаимодействуюзщих участков РНК и ДНК, их нуклеотидный состав и особенности определения триплексов исходной программной. Полученная модель позволяет проводить полногеномные и полнотранскриптомные сравнения, что в свою очередь позволяет выбирать кандидатные РНК, наиболее вероятно формирующие триплекс. Ранее нами было показано, что хотя предсказания триплексов с помощью программы Triplexator лучше других описывает экспериментальные данные, программа дает слишком много ложно-положительных предсказаний. Чтобы компенсировать этот недостаток, дополнительно к запланированным на этот год работам, были проведены тесты с учетом вторичной структуры РНК. То есть выделены участки РНК, которые скорее всего не спарены внутри РНК и потенциально могут связывать ДНК. Предсказания были валидированы на эксперимнетальных данных по полногеномному связыванию MEG3 с хроматином. Было показано, что использование только неспаренных участков РНК, полученным c помощью RNAplfold (Vienna) действительно повышают специфичность предсказания, не снижая чувствительности. Далее, нами был разработан прототип программного конвейера для поиска днкРНК, которые потенциально могут влиять на состояние хроматина путем образования триплексов с целевыми районами. Программный конвейер состоит из следующих основных блоков: (1) стандартизованный поиск участков модицикации гистонов в десятках образцов; (2) нормализация данных экспрессии днкРНК в этих же образцах; (3) корреляция численного значения пика модицикации гистонов и экспрессии днкРНК; (4) определение возможности образования триплекса между кандидатными парами ДНК-РНК и оценка его статистической значимости. Протопит протестироан на на примере гистоновой метки H3K27me3, поскольку известно, днкРНК MEG3, которая связывает ДНК, формируя триплекс, также участвует в установлении именно этой метки. Кроме этого, были проанализированы экспериментальных данные о взаимодействии РНК с хроматином, полученные в колаборации, а также публичные данные GRID-seq. Показано, что хотя абсолютное число межхромосомных контактов (РНК связывается с ДНК другой хромосомы) невелики, однако относительные частоты триплексов в них достаточно высоки. Также обнаружены РНК, которые формируют триплексы с большим количеством участков генома, что ранее про эти РНК не было известно. Также, с опережением графика был начат пилотный анализ данных, полученных в рамках консорциума FANTOM6, по изменению экспрессии при нокдауном различных РНК. Нами были проанализированы промоторы генов, значимо меняющих экспрессию при нокдауне ряда днкРНК и выявлены ряд РНК, которы значимо чаще вормируют триплексы среди промоторов, экспрессия которых значимо изменилась при нокдауне этой РНК. Эти данные указывают на возможный механизм регуляции экспрессии генов при помощи данной РНК, однако нуждаются в дальнейшей экспериметальной проверке.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 году в рамках завершена разработка статистических методов для анализа роли длинных некодирующих РНК в формировании профиля хроматина, а также программных конвейеров, инкорпорирующих эти методы. Конвейер был улучшен и доработан: уточнен отбор образцов, большая часть вычислений векторизована для увеличения скорости обработки заметно увеличившегося количества данных, разработаны методы статистической обработки данных нокдаунов, данных колокализации РНК и ДНК, данных метилирования. С помощью этого конвейера были проанализированы 10 эпигенетических модификаций и области переменного метилирования ДНК. Были более глубоко обработаны результаты анализа корреляций между экспрессией нкРНК и наличием гистоновой модификации в определенном локусе: скоррелированные пики ChIP-seq для модификаций были ассоциированы с регулируемми ими генами. В свою очередь, полученные списки генов, скоррелированных с конкретными нкРНК, были разделены по знаку корреляции. Мы предполагаем, что знак корреляции может указывать на функциональное значение корреляционной связи нкРНК-модификация-ген: положительная корреляция означает, что нкРНК может участвовать в проставлении модификации гистона, отрицательная корреляция означает, что нкРНК может участвовать в ее удалении. Далее, для функционального анализа, были инкорпорированы данные, полученные в рамках консорциума FANTOM6 по изменению экспрессии при нокдауне различных нкРНК. Для каждой нкРНК мы разделиои списки дифференциально экспрессирующихся генов при нокдауне по направлению изменения экспрессии. Для общих с нашими данными нкРНК из данных FANTOM6 была предсказана значимость пересечения списка генов, имеющих пики модификаций, имеющих корреляцию с нкРНК определенного знака, со списком диффэкспрессирующихся в определенную сторону генов из экспериментов FANTOM6. Таким образом было выделено 4 группы нкРНК по их функциональному значению: нкРНК ставящие репрессивные метки, нкРНК снимающие репрессивные метки, нкРНК ставящие активаторные метки, нкРНК снимающие активаторные метки. Также был проведен анализ колокализации нкРНК со скоррелированными участками ДНК с использованием данных iMARGi. Для оценки значимости колокализации разметок генома была использованная программа GenometricCorr. В результате для каждой модификации были получены коллекции нкРНК, потенциально вовлеченных в нацеливание гистоновых модификаторов на специфические геномные локусы и классифицированы в одну из 4х групп по возможному типу влияния на гистоновую метку. Также получен список нкРНК, которые потенциально влияют на метилирование в конкретных местах генома. Всего выявлено более 50 нкРНК, потенциально вовлеченных в изменение модификаций гистонов и метилирования ДНК. Полученные нкРНК были протестированы на возможность образования дуплексов нкРНК-РНК и триплексов нкРНК-ДНК с помощью программ ASSA, Triplexator и TDF. Среди найденных с помощью нашего конвейера нкРНК есть как описанные в литературе, так и нкРНК, роль которых не была показана ранее. Роль одной из них подтверждена экспериментально.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 году в рамках работ по проекту завершена разработка программного конвейера для анализа роли длинных некодирующих РНК в формировании профиля хроматина. Основным улучшением, сделанным в этом году является независимый анализ различных ASO, который позволяет с большей достоверностью определять нкРНК, которые участвуют в эпигенетической регуляции. С помощью этого конвейера были проанализированы десять эпигенетических модификаций и области переменного метилирования ДНК. По результатам анализа создана база данных HiMoRNA (himorna.fbras.ru), которая содержит 5640250 значимо скоррелированных длинных некодирующих РНК и участков генома для 10 модификаций гистонов и 4145 нкРНК. Чтобы охарактеризовать каждую пару нкРНК-геномный локус, мы также собрали серию метаданных для каждого взаимодействия. Разработанный программный конвейер выявил 48 нкРНК, потенциально вовлеченных в регуляцию хотя бы одной эпигенетической модификации, сопряженной с функциональными изменениями в экспрессии генов. Более половины этих РНК показали согласованный результат в биологических репликах, а также валидированы с помощью данных о взаимодействии РНК и хроматинка (iMARGI). Мы обнаружили крайне неравномерное хромосомное распределение локусов, в которых эпигенетическая модификация коррелирована с нкРНК. В частности, программный конвейер показывает сильную связь между FTX и метилированием ДНК и между JPX и H3K9me3. Как метилирование ДНК, так и H3K9me3 являются репрессивными модификаторами и, как известно, вносят вклад в различные стадии инактивации X. Мы показали, что почти все пики H3K9me3, ассоциированные с JPX, расположены на Х-хромосоме, что указывает на то, что JPX может также вносить вклад не только в регуляцию XIST как такового, но также и непосредственно в репрессию Х-хромосомы. Изучая механизмы взаимодействия нкРНК с целевыми районами, мы также показали, что около 30% всех нкРНК, подвергшихся нокдауну, могут регулировать целевые гены с помощью образования дуплексов нкРНК:РНК. Большинство таких длинных нкРНК, вероятно, функционируют в ядре, где они могут взаимодействовать с таргетными транскриптами в процессе их синтеза (котранскрипционно). Это наблюдение было также подтверждено экспериментальными данными о взаимодействии нкРНК-хроматин. нкРНК CHASERR наиболее вероятно формирует дуплексы нкРНК:РНК с регулируемыми генами ко-транскрипционно. Нами предложена модель, в рамках которой хеликаза CHD2, в комплексе с CHASERR, взаимодействующей с целевыми промоторами, активирует гены, вдали от мести транскрипции самой нкРНК. Выявлены консервативные участки данной нкРНК, наиболее вероятно участвующие в выполнении CHASERR своих функций. Нами также выявлены 14 нкРНК (CTD-3131K8.2, CTD-2587H24.5, AC124789.1, TUG1, RAB30-AS1, RP13-463N16.6, LINC00886, LINC00886, ZNF37BP, FTX, EMX2OS, FGD5-AS1, RP11-417E7.1, AC016747.3), которые могут образовывать РНК:ДНК триплексы с промоторами регулируемых генов, некоторые из них также вовлечены в эпигенетическую регуляцию. По результатам работы нами было выявлено 17 нкРНК, потенциально вовлеченных в регуляцию, по крайней мере, одной эпигенетической модификации. Среди найденных с помощью нашего конвейера нкРНК есть как описанные в литературе, так и нкРНК, роль которых не была показана ранее, либо была показана для других эпигенетических модификаций. Каждая нкРНК подвергласть повторному нокдауну, по крайней мере, двумя антисенс олигонуклеотидами (ASO), для целевой валидации. В дополнение к ранее запланированным работам, нами показана роль нкРНК ecCEBPA в регуляции метилирования про остром миелоидном лейкозе. Нами предложена модель регуляции метилирования ДНК посредством образования тройных спиралей нкРНК ecCEBPA и промоторов регулируемых генов. Показано также, что NR2F1-AS1 может являться губкой для микроРНК, таргетирующих ДЕГ, реагирующие на нокаут этой РНК. Нами также показано, что химерные транскрипты, играющие важную роль в канцерогенезе, формируют длинную шпильку, возможно, играющую аналогичную роль в качестве малых интерферирующих РНК (siRNA), препятствуя экспрессии генов. Наше исследование подчеркивает функциональную важность нкРНК независимо от уровня их экспрессии, локализации и консервативности, включая их особую роль в эпигенетической регуляции экспрессии генов. Молекулярное фенотипирование совмещенное с интеграцией мульти-омиксных данных позволяет проводить качественную функциональную аннотацию нкРНК, в том числе определять их роль в возникновении и прогрессе социально-значимых заболеваний, в частности онкологических. Полученные нами результаты выявляют новые цели для лекарственной терапии этих заболеваний.