КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 17-74-10172
НазваниеФизико-химические детерминанты селективного действия блокаторов калиевых каналов из яда скорпионов
РуководительТабакмахер Валентин Михайлович, Кандидат химических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2017 - 06.2019 |
Конкурс№23 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков
Ключевые словаблокаторы калиевых каналов, потенциал-чувствительные калиевые каналы, яд скорпионов, белок-белковые взаимодействия, молекулярная поверхность, молекулярное моделирование, молекулярная динамика, метод белковой топографии, биоинженерия, электрофизиологические измерения, метод двухэлектродной фиксации потенциала, рациональное конструирование высокоактивных пептидов
Код ГРНТИ34.15.15
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Потенциал-чувствительные калиевые каналы (Kv) – семейство трансмембранных белков, формирующих поры в цитоплазматической мембране, которые специфичны к ионам калия и чувствительны к изменениям мембранного потенциала клетки. Члены этого семейства присутствуют в мембранах практически всех типов электровозбудимых клеток и участвуют в различных физиологических процессах, включая реполяризацию мембраны при потенциале действия и развитие гиперполяризации, передачу нервного сигнала, клеточную пролиферацию и миграцию, кальциевый сигналинг [1,2]; а также вовлечены в развитие патологических состояний: болевых [3], аутоиммунных, неврологических [4] и онкологических [5]. Направленная регуляция активности Kv не только поможет пролить свет на молекулярные основы функционирования этих сложных биологических систем, но и эффективно решать проблемы, возникающие при его нарушении. В связи с этим, Kv привлекают исследовательский интерес как перспективные мишени в направленной терапии разнообразных заболеваний, а их лиганды – модуляторы, активаторы и блокаторы, – рассматриваются (и зачастую уже используются) как специфические регуляторы активности этих белков (например, ретигабин – активатор Kv7 – противоэпилептический препарат) [6–10].
Целью данного проекта является установление на молекулярном уровне детерминант селективного действия блокаторов потенциал-чувствительных калиевых каналов из яда скорпионов с применением методов компьютерного моделирования, подходов белковой биоинженерии и молекулярной электрофизиологии.
Для решения поставленных задач будет использован недавно разработанный в ИБХ РАН перспективный компьютерный метод анализа физических свойств и структуры белков – белковая топография [11], – который уже показал свою эффективность при исследовании механизмов селективности белковых нейротоксинов [12] и дизайне высокоаффинных пептидных лигандов нейрональных рецепторов [13,14]. Кроме того, планируется применение нового вычислительного подхода, основанного на анализе специфических и неспецифических контактов в молекулярных комплексах [15]. Представляемый проект является частью и логическим продолжением совместного исследования структуры и функций нейротоксинов из яда скорпионов, проводимых группой молекулярных инструментов для нейробиологии и лабораторией моделирования биомолекулярных систем ИБХ РАН. Многолетнее плодотворное сотрудничество этих подразделений позволило достичь значительных успехов на стыке компьютерного и экспериментального подходов к решению задач структурной биологии и молекулярной нейробиологии.
Одним из результатов этого сотрудничества стала исчерпывающая база структурных и функциональных данных о блокаторах калиевых каналов из ядов скорпионов Kalium (http://kaliumdb.org/) [16]. Для изучения взаимосвязи физико-химических и структурных характеристик исследуемых биомолекул с их активностью на основании данных Kalium и данных сайт-направленного мутагенеза KTx и Kv будет составлена выборка токсинов, имеющих различную специфичность/аффинность взаимодействия с Kv млекопитающих. Конкретными мишенями выступят подтипы Kv1.1 – Kv1.6, поскольку: (а) для них получены наиболее полные данные о структуре и механизмах функционирования, (б) эти изоформы представляют особый интерес с точки зрения фармакологии и (в) известна кристаллическая структура «вестибюля» поры канала Kv1.2 [17], что предоставляет уникальные возможности для исследования межмолекулярных взаимодействий методами компьютерного моделирования и молекулярной динамики.
Для выбранных токсинов будут получены модели пространственных структур с помощью моделирования по гомологии с родственными KTx, для которых пространственная структура изучена экспериментально. Для всех изучаемых молекул будут проведены расчеты молекулярной динамики (МД) в явно заданном водном окружении длительностью порядка 10-7с с использованием программного пакета GROMACS [18]. Это позволит изучить конформационную подвижность токсинов и учесть их динамику при анализе структурных и физико-химических особенностей.
В водном растворе изучаемые пептиды представляют собой компактные глобулы, что позволяет в первом приближении рассматривать их как сферические объекты. Планируется использовать предложенный ранее метод белковой топографии для описания свойств этих молекул в терминах сферических карт-разверток, позволяющих наглядно и детально описать распределение гидрофобных (и/или электростатических) свойств и рельеф молекулярной поверхности.
Метод белковой топографии основан на построении молекулярной поверхности и расчете в их точках различных физико-химических и геометрических свойств. Примерами рассчитываемых параметров являются электростатический потенциал, гидрофобные свойства (согласно формализму молекулярного гидрофобного потенциала, МГП), рельеф, локальная кривизна поверхности и другие. С использованием этого метода ранее удалось выявить базовые принципы селективного действия млеко- и инсектотоксинов из яда скорпионов, воздействующих на натриевые каналы [12], расширить понимание молекулярных механизмов работы конотоксинов, селективно действующих на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, и создать новые высокоактивные лиганды этих рецепторов [13,14]. Преимущество метода заключается в возможности не только проводить анализ структуры и свойств отдельных молекул, но и выявлять общее и различное у представителей целых групп гомологичных белков, включающих десятки соединений. Предполагается, что развитие метода позволит выявлять физико-химические детерминанты селективного действия самых разнообразных биологически активных пептидов и белков, и, в первую очередь, блокаторов калиевых каналов – основных объектов исследования в данном проекте.
Кроме того, будут построены модели молекулярных комплексов конкретных токсинов (из пула отобранных молекул) с отдельными изоформами Kv, и проведен расчет траекторий молекулярной динамики в водно-липидном окружении, имитирующем цитоплазматическую мембрану. На этом этапе работы для выявления структурно-функциональных взаимосвязей планируется применить новый комплекс подходов, основанный на учете и анализе специфических и неспецифических межмолекулярных контактов в комплексах KTx-Kv, успешно использованный нами ранее при решении задач, подобных сформулированным в настоящем проекте [15].
Результаты разных типов компьютерного анализа (описанных выше) будут обобщены, соотнесены с конкретными элементами структуры токсинов и сопоставлены с экспериментальными данными по их активности. Полученные результаты будут использованы для направленной инженерии KTx. Во-первых, будет предложен один или несколько вариантов аналогов природных KTx с заданной специфичностью; во-вторых, будет предложен набор точечных изменений структуры пептидов, исходно не обладающих блокирующей активностью в отношении Kv, которые приведут к ее появлению.
Пептиды с рационально измененной структурой будут получены в бактериальной системе экспрессии с использованием подхода, зарекомендовавшего себя при выполнении подобных работ по получению дисульфид-богатых пептидов [19]. Искомые KTx будут продуцированы в специальных штаммах Escherichia coli (Origami, Shuffle) в виде химер с белком-помошником тиоредоксином, который будет затем отделен с помощью селективного протеолиза. Активность рекомбинантных KTx будет оценена в отношении целевых Kv с помощью современных методов электрофизиологии. Гены каналов будут экспрессированы в ооцитах шпорцевой лягушки, после чего влияние KTx на токи через соответствующие Kv будет измерено с использованием метода двухэлектродной фиксации потенциала (voltage clamp), что является общепринятой практикой [20].
Литература
1. Kodirov S.A. et al. [Superfamily of voltage dependent K+ channels: structure, functions and pathology]. // Tsitologiia. 2010. Vol. 52, № 9. P. 697–714.
2. Zhu S. et al. Molecular diversity and functional evolution of scorpion potassium channel toxins. // Mol. Cell. Proteomics. 2011. Vol. 10, № 2. P. M110.002832.
3. Ocaña M. et al. Potassium channels and pain: present realities and future opportunities. // Eur. J. Pharmacol. 2004. Vol. 500, № 1–3. P. 203–219.
4. Wulff H., Zhorov B.S. K+ channel modulators for the treatment of neurological disorders and autoimmune diseases. // Chem. Rev. 2008. Vol. 108, № 5. P. 1744–1773.
5. Pardo L.A., Stühmer W. The roles of K(+) channels in cancer. // Nat. Rev. Cancer. 2014. Vol. 14, № 1. P. 39–48.
6. Kale V.P., Amin S.G., Pandey M.K. Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs // Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 2015. Vol. 1848, № 10. P. 2747–2755.
7. Zhao Y. et al. Toxins Targeting the KV1.3 Channel: Potential Immunomodulators for Autoimmune Diseases // Toxins (Basel). 2015. Vol. 7, № 5. P. 1749–1764.
8. Breland A.E., Currier R.D. Scorpion venom and multiple sclerosis. // Lancet (London, England). 1983. Vol. 2, № 8357. P. 1021.
9. Lewis R.J., Garcia M.L. Therapeutic potential of venom peptides. // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2, № 10. P. 790–802.
10. Wulff H., Castle N.A., Pardo L.A. Voltage-gated potassium channels as therapeutic targets. // Nat. Rev. Drug Discov. 2009. Vol. 8, № 12. P. 982–1001.
11. Koromyslova A.D., Chugunov A.O., Efremov R.G. Deciphering fine molecular details of proteins’ structure and function with a Protein Surface Topography (PST) method. // J. Chem. Inf. Model. 2014. Vol. 54, № 4. P. 1189–1199.
12. Chugunov A.O. et al. Modular organization of α-toxins from scorpion venom mirrors domain structure of their targets, sodium channels. // J. Biol. Chem. 2013. Vol. 288, № 26. P. 19014–19027.
13. Kasheverov I.E. et al. High-Affinity α-Conotoxin PnIA Analogs Designed on the Basis of the Protein Surface Topography Method // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 6, № October. P. 36848.
14. Kasheverov I.E. et al. Rational design of new ligands for nicotinic receptors on the basis of α-conotoxin PnIA. // Dokl. Biochem. Biophys. 2015. Vol. 461. P. 106–109.
15. Kuzmenkov A.I. et al. C-Terminal residues in small potassium channel blockers OdK1 and OSK3 from scorpion venom fine-tune the selectivity // Biochim. Biophys. Acta - Proteins Proteomics. 2017.
16. Kuzmenkov A.I. et al. Kalium: A database of potassium channel toxins from scorpion venom // Database. 2016. Vol. 2016.
17. Banerjee A. et al. Structure of a pore-blocking toxin in complex with a eukaryotic voltage-dependent K(+) channel. // Elife. 2013. Vol. 2. P. e00594.
18. Abraham M.J. et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers // SoftwareX. 2015. Vol. 1. P. 19–25.
19. Pluzhnikov K. et al. omega-Lsp-IA, a novel modulator of P-type Ca2+ channels. // Toxicon. 2007. Vol. 50, № 7. P. 993–1004.
20. Kuzmenkov A.I. et al. Variability of Potassium Channel Blockers in Mesobuthus eupeus Scorpion Venom with Focus on Kv1.1: AN INTEGRATED TRANSCRIPTOMIC AND PROTEOMIC STUDY. // J. Biol. Chem. 2015. Vol. 290, № 19. P. 12195–12209.
Ожидаемые результаты
Проект направлен на проведение структурно-функциональных исследований пептидных блокаторов потенциал-чувствительных калиевых каналов из яда скорпионов с применением методов молекулярного компьютерного моделирования и белковой инженерии.
Ожидаемые результаты:
1. С использованием самых последних и актуальных экспериментальных данных будет составлена выборка токсинов из яда скорпионов, имеющих различную специфичность/аффинность взаимодействия с потенциал-чувствительными калиевыми каналами млекопитающих.
2. Будут созданы модели пространственных структур блокаторов калиевых каналов на основании гомологии с родственными белками, для которых имеются экспериментально полученные структуры.
3. Будет произведен расчет траекторий молекулярной динамики всех отобранных молекул в явно заданном водном окружении для оценки конформационной подвижности исследуемых молекул. Этот результат будет учтен при последующем анализе физических свойств, распределенных на их поверхности.
4. Будут построены модели молекулярных комплексов конкретных токсинов (из пула отобранных молекул) с отдельными изоформами потенциал-чувствительных калиевых каналов, и проведен расчет траекторий молекулярной динамики в водно-липидном окружении, имитирующем цитоплазматическую мембрану.
5. С использованием специально разработанного программного обеспечения будет проведен качественный и количественный анализ физико-химических свойств поверхности исследуемых токсинов (гидрофобные характеристики, электростатический потенциал, рельеф молекулярной поверхности), а также выявлены специфические и неспецифические межмолекулярные контакты в их комплексах с потенциал-чувствительными калиевыми каналами.
6. Будут определены общие черты и характерные структурные, динамические и другие физико-химические различия для молекул, проявляющих различную специфичность/аффинность, а также установлена взаимосвязь между параметрами, полученными в ходе моделирования, и экспериментальными данными о взаимодействии изучаемых токсинов с потенциал-чувствительными калиевыми каналами (то есть выявлены молекулярные детерминанты селективного действия).
7. С учетом полученных результатов будут предложены один или несколько вариантов аналогов природных токсинов из яда скорпионов с заданной специфичностью/аффинностью.
8. С целью направленного модулирования селективного действия в отношении потенциал-чувствительных калиевых каналов методами белковой инженерии будут проведены точечные изменения в структуре неактивного токсина.
9. Будет проведен биотехнологический синтез и с помощью методов электрофизиологии осуществлена экспериментальная проверка активности спроектированных соединений на потенциал-чувствительных калиевых каналах.
Глубокое понимание структурных основ селективных межмолекулярных взаимодействий открывает путь к управлению огромным числом биохимических процессов, расширяет возможности фармацевтики и медицины при разработке новых лекарств и терапевтических подходов. Калиевые каналы присутствуют практически во всех клетках живого организма, многие их изоформы вовлечены в патогенез различных заболеваний. В связи с этим, принципиально важной задачей является создание и поиск новых селективных лигандов, действующих на эти мембранные белки. Такие лиганды обладают высоким потенциалом в качестве прототипов новых лекарственных препаратов направленного действия и, кроме того, могут быть использованы в качестве молекулярных инструментов исследования нейросигнализации. Главным требованием к таким молекулам является высокая специфичность по отношению к определенным подтипам калиевых каналов. При этом эффект на другие молекулярные мишени должен отсутствовать или быть сведен к минимуму.
Результаты проекта значительно углубят наши представления о молекулярных основах функционирования биологических систем, в частности, о лиганд-рецепторных взаимодействиях и механизмах нейросигнализации, и расширят возможности их высокоэффективной и направленной регуляции. Кроме того, полученные данные могут стать основой для рационального конструирования новых молекулярных инструментов исследования калиевых каналов и разработки препаратов для лечения патологических состояний, обусловленных дисфункцией этих мембранных белков.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проведены работы по трем направлениям.
1. Рациональный дизайн структуры блокатора потенциал-чувствительных калиевых каналов на основе структуры токсина, не проявляющего активности в отношении калиевых каналов.
Хлоротоксин-подобные пептиды (CLTx) и блокаторы калиевых каналов α-типа (α-KTx) – две группы пептидных токсинов, выделенных из яда скорпионов. Пространственная структура CLTx имеет много общего со структурой α-KTx, однако в отличие от α-KTx, CLTx не взаимодействуют с потенциал-чувствительными калиевыми каналами (Kv). Оптимизация структуры токсина из группы CLTx с целью получения пептида, активного в отношении Kv, представляется вполне логичным и осуществимым шагом на пути выявления структурных детерминант, которые обусловливают эту активность.
Были составлены две выборки молекул: α-KTx (36 токсинов) и CLTx (16 токсинов). Для тех пептидов каждой выборки, пространственные структуры которых пока не установлены, методами компьютерного молекулярного моделирования были построены их 3D-модели. Для оценки конформационной подвижности каждого токсина с использованием суперкомпьютерных вычислений были проведены расчеты молекулярной динамики (МД) в водном окружении. Для анализа распределения физико-химических свойств на поверхности токсинов был применен метод белковой топографии [1-3], позволяющий наглядно и детально описывать характеристики белков и пептидов в виде сферических карт-разверток (подобно тому, как географические карты описывают земную поверхность). С использованием таких карт были выявлены наиболее различающиеся области поверхностей α-KTx и CLTx, что позволило предложить конкретные изменения в структуре CLTx, которые «приближают» распределение анализируемых свойств к таковому на поверхности α-KTx. Таким образом были предложены структуры трех пептидов с рационально измененной структурой на основе хлоротоксин-подобного пептида I5A.
Предложенные пептиды были получены биотехнологически, их способность взаимодействовать с калиевыми каналами была протестирована в электрофизиологических экспериментах с каналами Kv1.2 и Kv1.3. Однако, даже в высоких концентрациях синтетические пептиды не оказывали ингибирующего эффекта (вероятно потому, что внесенные изменения препятствовали формированию правильной пространственной структуры). Поэтому стратегия рационального конструирования блокатора Kv была изменена: на основе пептида I5A были предложены структуры трех новых пептидов, заимствующие часть структуры у харибдотоксина – классического и наиболее подробно исследованного представителя группы α-KTx. Пептиды были получены биотехнологически; в исследовании их активности на калиевых каналах было показано, что два из них ингибируют ионные токи, опосредованные Kv1.3.
Полученные результаты, во-первых, указывают на важность изменений, внесенных в структуру I5A, для взаимодействия с каналом Kv1.3; во-вторых, вносят большой вклад в установление структурных детерминант активности и селективного действия блокаторов калиевых каналов из яда скорпионов; в-третьих, открывают новые возможности для конструирования высокоспецифичных лигандов калиевых каналов.
2. Исследование структурного базиса селективности высокогомологичных блокаторов потенциал-чувствительных калиевых каналов из яда скорпиона Mesobuthus eupeus.
Ранее из яда скорпиона Mesobuthus eupeus были выделены два новых токсина семейства α-KTx: MeKTx11-1 (α-KTx 1.16) и MeKTx11-3 (α-KTx 1.17) [4], отличающиеся лишь двумя аминокислотными остатками. Оба токсина взаимодействуют с Kv1.2 предпочтительнее, чем с Kv1.3, но активность MeKTx11-1 в отношении этого канала более чем в 15 раз превосходит активность MeKTx11-3. С целью объяснения различий в активности этих токсинов (то есть установления структурного базиса их селективности) мы провели компьютерное исследование их взаимодействия с калиевыми каналами и экспериментально проверили полученные результаты.
Для решения этой задачи с помощью методов компьютерного молекулярного моделирования были созданы 3D-модели структуры этих пептидных токсинов (и их мутантных форм), а также калиевых каналов Kv1.2 и Kv1.3, использованные впоследствии для построения межмолекулярных комплексов «пептид–канал». Для каждого комплекса с использованием суперкомпьютерных вычислений были проведены расчеты молекулярной динамики (МД) в водно-липидном окружении, имитирующем клеточную мембрану нейрона. Во всех полученных траекториях МД был выполнен анализ межмолекулярных контактов. Были установлены конкретные аминокислотные остатки Kv1.3, которые, в отличие от аналогичных участков Kv1.2, не способны образовывать контакты с исследуемыми токсинами, что объясняет более высокую активность в отношении Kv1.2. Кроме того, были выявлены структурно-динамические особенности токсинов, объясняющие более высокую активность MeKTx11-1 в отношении Kv1.2 по сравнению с MeKTx11-3. Для подтверждения результатов компьютерного анализа были сконструированы и биотехнологически получены мутантные формы канала Kv1.3, в которых некоторые изоформ-специфические остатки были заменены на аналогичные остатки Kv1.2. Электрофизиологическое тестирование активности исследуемых токсинов на мутантных каналах подтвердило результаты компьютерного исследования.
Таким образом, проведенное исследование позволило выявить детерминанты селективного действия на калиевые каналы токсинов MeKTx11-1 и MeKTx11-3.
3. Применение метода белковой топографии для увеличения аффинности взаимодействия пептидного блокатора с потенциал-чувствительным калиевым каналом.
Ранее на основе пептида из пшеницы Tk-AMP-X2, который не оказывает эффекта на потенциал-чувствительные калиевые каналы, был сконструирован короткий пептид Tk-hefu, проявляющий блокирующее действие на канал Kv1.3 в высоких концентрациях (~35 мкМ) [5]. Фактически, этот синтетический токсин является структурным гомологом блокаторов калиевых каналов из яда скорпионов κ-типа.
С целью увеличения аффинности (то есть, уменьшения действующей концентрации) Tk-hefu, мы провели компьютерное исследование его взаимодействия с Kv1.3. Для этого методами молекулярного моделирования была создана 3D-модель структуры комплекса Tk-hefu с Kv1.3. Для полученного комплекса с использованием суперкомпьютерных вычислений были проведены расчеты молекулярной динамики (МД) в водно-липидном окружении, имитирующем клеточную мембрану нейрона. С использованием метода белковой топографии [1-3] были рассчитаны динамические карты распределения электростатического потенциала для Tk-hefu и Kv1.3 в составе их комплекса. Анализ карт позволил оценить комплементарность (соответствие) электростатических свойств непосредственно взаимодействующих участков токсина и рецептора и предложить конкретные изменения (единственную аминокислотную замену) в структуре токсина, которые увеличивают комплементарность. Пептид с измененной структурой, названный Tk-hefu-2, был получен биотехнологически. В электрофизиологическими тесте Tk-hefu-2 продемонстрировал эффективное ингибирование Kv1.3 в концентрации 2 мкМ, то есть, по сравнению с пептидом Tk-hefu, его активность оказалась более чем в 15 раз выше.
Таким образом, в результате «тонкой настройки» электростатических характеристик молекулярной поверхности синтетического пептида Tk-hefu был получен пептид Tk-hefu-2, значительно более аффинный к Kv1.3. Полученные результаты будут использованы для создания новых высокоаффинных пептидных блокаторов калиевых каналов.
1. Koromyslova AD, Chugunov AO, Efremov RG (2014) Deciphering fine molecular details of proteins’ structure and function with a Protein Surface Topography (PST) method. J Chem Inf Model 54(4):1189–99.
2. Chugunov AO, et al. (2013) Modular organization of α-toxins from scorpion venom mirrors domain structure of their targets, sodium channels. J Biol Chem 288(26):19014–27.
3. Kasheverov IE, et al. (2016) High-Affinity α-Conotoxin PnIA Analogs Designed on the Basis of the Protein Surface Topography Method. Sci Rep 6. doi:10.1038/srep36848.
4. Kuzmenkov AI, et al. (2015) Variability of Potassium Channel Blockers in Mesobuthus eupeus Scorpion Venom with Focus on Kv1.1: AN INTEGRATED TRANSCRIPTOMIC AND PROTEOMIC STUDY. J Biol Chem 290(19):12195–209.
5. Berkut AA, et al. (2014) Structural Similarity between Defense Peptide from Wheat and Scorpion Neurotoxin Permits Rational Functional Design. J Biol Chem 289(20):14331–14340.
Публикации
Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проведены работы по двум направлениям.
1. Увеличение аффинности связывания блокатора потенциал-чувствительных калиевых каналов. Создание блокатора с заданной специфичностью.
В первом году реализации проекта в результате подробного компьютерного анализа и «тонкой настройки» электростатических характеристик молекулярной поверхности синтетического пептида Tk-hefu был получен пептид Tk-hefu-2, активный в отношении потенциал-чувствительного калиевого канала Kv1.3 в концентрации 2 мкМ, оказывающий слабый ингибирующий эффект на другие потенциал-чувствительные калиевые каналы. Данный результат послужил основой для создания высокоаффинного блокатора калиевых каналов с заданной специфичностью.
Анализ проделанной ранее работы позволил сделать выводы о физических характеристиках поверхности пептида, которые способствуют взаимодействию с калиевым каналом. Для проверки сделанного вывода на основе Tk-hefu-2 были предложены структуры четырех пептидов, предположительно имеющих более высокое сродство к Kv1.3; смоделированы структуры их комплексов с потенциал-чувствительными калиевыми каналами Kv1.3 и Kv1.2; рассчитаны траектории молекулярной динамики (МД); проведен вычислительный анализ контактных поверхностей и энергетических вкладов остатков в комплексообразование; осуществлен биотехнологический синтез мутантных пептидов и протестирована активность в электрофизиологических экспериментах. В результате, в индивидуальном состоянии был получен пептид Tk-hefu-15, имеющий единственную аминокислотную замену по сравнению с Tk-hefu-2, остальные три пептида не были использованы для последующих экспериментальных исследований ввиду отсутствия корректной пространственной структуры. Однако, полученный пептид Tk-hefu-15 продемонстрировал в 3 раза более высокую активеность в отношении Kv1.3, чем Tk-hefu-2 (величина IC50 составила 0.7 мкМ).
Полученные вычислительные и экспериментальные результаты, как положительные, так и отрицательные, позволили не только оценить корректность наших выводов о физических параметрах, которыми должны обладать исследуемые пептиды для более эффективного связывания с калиевыми каналами, но и пролить свет на структурный базис их специфичности в отношении Kv1.3.
С учетом полученных результатов, для дополнительного увеличения аффинности исследуемых пептидов к Kv1.3 мы изменили стратегию внесения модификаций. С целью оценки влияния аминокислотных замен на взаимодействие с каналом, были предложены структуры одиннадцати пептидов, предположительно имеющих более высокое сродство к Kv1.3, чем Tk-hefu-15. Были построены модели предложенных пептидов и их комплексов с Kv1.3, проведен расчет траекторий МД, анализ межмолекулярных контактов и расчет энергетических профилей взаимодействия пептидов с Kv1.3. Проведенное компьютерное исследование позволило выявить наиболее благоприятные аминокислотные замены.
Эти результаты были использованы для проведения второго раунд внесения изменений в структуру пептида Tk-hefu-2: были предложены структуры четырех пептидов, предположительно обладающих более высокой аффинностью к Kv1.3, чем Tk-hefu-15. Предложенные пептиды были получены биотехнологически в бактериальной экспрессионной системе, их активность была протестирована методом двухэлектродной фиксации потенциала на панели Kv. Было показано, что все полученные пептиды в концентрации 0,7 мкМ ингибируют токи, опосредованные каналом Kv1.3. Для пептидов Tk-hefu-21, Tk-hefu-22 и Tk-hefu-23 продемонстрирована предпочтительная специфичность действия на Kv1.3. Показано, что наиболее активный пептид Tk-hefu-23 в концентрации 75,7 нМ (IC50) ингибируют токи, опосредованные каналом Kv1.3, а в концентрации 5 мкМ ингибируют токи, опосредованные Kv1.2 (на 50 %) и Kv1.6 (на 30 %).
Резюме. Во втором году реализации проекта в результате двух раундов внесения модификаций в структуру синтетического блокатора калиевых каналов Tk-hefu-2, был получен пептид Tk-hefu-23. Было установлено, что активность Tk-hefu-23 в отношении Kv1.3 (IC50 = 75,7 нМ) в 66 раз выше его активности в отношении Kv1.2 (IC50 = 5 мкМ). Следует отметить, что активность данного пептида на два порядка выше, чем активность Tk-hefu (IC50 в отношении Kv1.3 различается в 462 раза), являвшегося «стартовой» точкой для получения высокоаффиного пептида в рамках данного направления в начале первого года реализации проекта. Таким образом, применение комбинации методов компьютерного анализа и биотехнологических подходов позволило добиться высокой аффинности и заданной специфичности действия пептида к конкретному подтипу Kv.
2. База данных полипептидных лигандов калиевых каналов.
Ранее нами была создана исчерпывающая база структурных и функциональных данных о блокаторах калиевых каналов из ядов скорпионов Kalium [1]. Kalium – открытая база данных, доступная для любых категорий пользователей интернета (http://kaliumdb.org/). В процессе выполнения работ за первый год реализации проекта был проведен большой литературный поиск и глубокий анализ свободно доступных данных о структуре и функциональной активности блокаторов потенциал-чувствительных калиевых каналов из ядов скорпионов. При этом, база данных Kalium значительно облегчила и ускорила поиск и анализ необходимой структурной и функциональной информации.
Тем не менее, с момента создания базы в 2016 году в свободном доступе появилось значительное количество новых данных о пептидах из яда скорпионов, проявляющих активность в отношение Kv. Эти данные были аккумулированы, систематизированы нашим научным коллективом и добавлены в Kalium. Кроме того, мы собрали все фармакологические данные, имеющиеся в свободном доступе, практически обо всех полипептидных лигандах калиевых каналов из других организмов.
Данные по всем общедоступным последовательностям полипептидных лигандов калиевых каналов были получены из UniProt (http://www.uniprot.org/). Информация о доступных структурах PDB со ссылками на RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org) и расположении дисульфидных связей также были извлечены из UniProt. Данные были вручную отфильтрованы и уточнены, а также сгруппированы в шесть групп согласно таксономической принадлежности организма-источника: «змеи», «скорпионы», «пауки», «морские анемоны», «улитки конусы» и «разное», что нашло отражение в пользовательском интерфейсе в виде кнопок выбора группы организмов. Для всех полипептидов были рассчитаны молекулярные массы с учетом ко- и посттрансляционных модификаций.
В Kalium 2.0 (http://kaliumdb.org/) реализован поиск, упорядочение и фильтрация поискового запроса по нескольким критериям, а также множественный выбор результатов поиска; реализован поиск последовательностей с помощью BLAST и выравнивание последовательностей с использованием программы Clustal Omega, а также экспорт данных в текстовом формате; все эти опции являются новыми. Расширенная информация, включая подробные данные об активности, доступна для каждого полипептида в виде специального всплывающего окна.
В результате, обновленная база данных, содержит в два раза больше записей, чем начальная версия, а также имеет улучшенный пользовательский интерфейс и расширенный функционал.
1. Kuzmenkov A.I. et al. Kalium: A database of potassium channel toxins from scorpion venom // Database. 2016. Vol. 2016: baw056.
Публикации
1. Кузьменков А.И., Некрасова О.В., Пейгню С., Табакмахер В.М., Гиголаев А.М., Фрадков А.Ф., Кудряшова К.С., Чугунов А.О., Ефремов Р.Г., Титгат Й., Феофанов А.В., Василевский А.А. Kv1.2 channel-specific blocker from Mesobuthus eupeus scorpion venom: Structural basis of selectivity Neuropharmacology, Volume 143, Pages 228-238 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.neuropharm.2018.09.030
2. Табакмахер В.М., Крылов Н.А., Кузьменков А.И, Ефремов Р.Г., Василевский А.А. Kalium 2.0, a comprehensive database of polypeptide ligands of potassium channels Scientific Data, - (год публикации - 2019)
Возможность практического использования результатов
Полученные в результате реализации проекта пептидные блокаторы потенциал-чувствительных калиевых каналов (Kv) и данные об их структурно-функциональных взаимосвязях и структурном базисе селективного действия этих пептидов могут быть использованы в качестве фундаментальной основы при разработке препаратов для распознавания и лечения патологических состояний, обусловленных дисфункцией Kv, а также для создания инновационных молекулярных инструментов их исследования. Разработанные подходы рационального конструирования высокоаффинных и специфичных блокаторов Kv могут быть применены для создания других пептидов с заданными физическими характеристиками и функциональной активностью. Кроме того, расширенная и улучшенная база данных Kalium (https://kaliumdb.org/) доступна для использования любыми категориями пользователей уже сейчас. Она имеет первостепенное значение для исследователей, изучающих структуру и функции калиевых каналов; для токсинологов, занимающихся изучением вариабельности и способов действия природных токсинов; для фармакологов и менеджеров по исследованиям и разработкам, занимающихся поиском лекарств, которые нацелены на калиевые каналы; и для биохимического сообщества в целом.