Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Нами были обнаружены и секвенированы гены люцифераз биолюминесцентных грибов Armillaria gallica, Armillaria mellea, Armillaria ostoyae, Mycena chlorophos, Mycena citricolor, Neonothopanus nambi, Omphalotus olearius, Panellus stipticus. Функция белков, закодированных данными генами, была подтверждена в гетерологической системе экспрессии (культура клеток млекопитающих HEK293T). Среди люцифераз различных грибов была выбрана самая эффективная для использования в гетерологической системе: люцифераза гриба Neonothopanus nambi. Путем анализа геномного контекста обнаруженных генов люцифераз и идентификации метаболических кластеров генов определены первичные структуры ДНК генов гиспидинсинтазы и гиспидин-3-гидроксилазы биолюминесцентной системы базидиомицетов; Получены отдельные векторные конструкции для экспрессии генов гиспидинсинтазы (HispS), гиспидин-3-гидроксилазы (H3H) и люциферазы (Luz) в дрожжах Pichia pastoris. Наработаны и очищены рекомбинантные белки (гиспидин-3-гидроксилаза, люцифераза) в количествах, достаточных для последующих биохимических исследований. Наработка и очистка белка гиспидинсинтазы из грибов признана нецелесообразной в силу большого размера данного белка (185 kDa по предсказаниям). Полученные векторы оптимизированы для экспрессии генов в организмах-кандидатах на создание гетерологических систем автономной биолюминесценции эукариот (дрожжи, культура клеток млекопитающих). Основным результатом работы над проектом на данной стадии является определение генов, кодирующих белки биолюминесцентной системы грибов (hisps, h3h и luz), а также предсказание белка, необходимого для функционирования HispS: 4-фосфопантетеинилтрансфераза (NpgA из Aspergillus nidulans). Новости проекта публикуются на сайте лаборатории http://www.ibch.ru/structure/groups/TotalSynthesis

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В первый год выполнения проекта мы идентифицировали и клонировали гены, предположительно кодирующие ферменты биосинтеза люциферина грибов, а именно: ген гиспидин-синтазы (HispS) и гиспидин – гидроксилазы (H3H). Мы предположили, что HispS синтезирует гиспидин из кофейной кислоты и малонил-CoA, а H3H окисляет гиспидин в 3-гидроксигиспидин, который, как было установлено ранее, и является люциферином грибов. Также мы предположили, что для корректной работы гиспидин-синтазы необходим фермент 4-фосфопантетеинилтрансфераза и клонировали соответствующий ген (Npga из Aspergillus nidulans). Основной задачей отчетного этапа было экспериментальное подтверждение функций этих ферментов и изучение их свойств, а также оптимизация условий для их функционирования в модельном организме. Анализ аминокислотной последовательности гиспидин-гидроксилазы выявил ее сходство с 3-гидроксибензоат 6-монооксигеназами, которые окисляют 3-гидроксибензоаты, используя NADH и кислород. Превращение гиспидина в люциферин происходит похожим образом (окислением ароматического кольца). Используя данные о третичной структуре гомологов гиспидин-гидроксилазы (салицилат-гидроксилазы и других), мы предложили модель третичной структуры этого белка. Используя полученную модель, мы предположили возможное строение участка, связывающего кофактор, и собственно активного центра. Выявленные нами предположительные аминокислоты активного центра являются консервативными как у ближайших гомологов гиспидин-синтазы из высших грибов, так и у 3-гидроксибензоат 6- монооксигеназ. Анализ первичной последовательность гиспидинсинтазы выявил два домена: один гомологичен ацил-СоА-лигазам, второй гомологичен стирилпирон-синтазам. Такая мультидоменная структура характерна для поликетидсинтаз, осуществляющих синтез разнообразных вторичных метаболитов. Для подтверждения предполагаемых функций этих генов мы экспрессировали их в эукариотических гетерологичных системах. В качестве модельных организмов для экспрессии изучаемых генов были выбраны дрожжи Pichia pastoris и культура клеток млекопитающих НЕК293Т. Для детекции образования люциферина использовалась люцифераза грибов. Мы установили, что при коэкспрессии гиспидин-гидроксилазы и люциферазы в модельных организмах при добавлении к ним гиспидина возникает хорошо детектируемая люминесценция. При этом при одиночной экспрессии этих генов при добавлении гиспидина люминесценция отсутствует. Таким образом, клонированный нами ген H3H действительно является геном гиспидин-гидроксилазы. Затем мы проверили работу гиспидин-синтазы. Для этого в модельных организмах были одновременно экспрессированы люцифераза, гиспидин-гидроксилаза и гиспидин-синтаза. Однако при добавлении кофейной кислоты люминесценция отсутствовала, что свидетельствовало о неактивности гиспидин-синтазы. Для решения этой проблемы мы коэкспрессировали четыре гена – люциферазу, гиспидин-гидроксилазу, гиспидин-синтазу и 4-фосфопантетеинилтрансферазу в дрожжах. При добавлении к полученному штамму кофейной кислоты возникала яркая люминесценция, видимая невооруженным глазом. В случае отсутствия хотя бы одного из вышеперечисленных генов добавление кофейной кислоты не приводило к возникновению люминесценции. Таким образом, клонированый нами ген HispS действительно является геном гиспидин-синтазы, а кодируемый им белок требует посттрансляционной модификации – фосфопантетеинилирования. Добавление в модельную систему гена ацетил-КоА-карбокислазы (ACC1), синтезирующей малонил-CoA, не приводило к увеличению люминесцентного сигнала. Также мы попытались повысить эффективность биолюминесцентной системы путем слияния люциферазы и гиспидин-синтазы в одну полипетидную цепь. Для этого мы клонировали соответствующие открытые рамки считывания, соединив их последовательностью, кодирующей линкерный участок. Были созданы три различных варианта соединения люциферазы и гиспидин-гидроксилазы, однако активность (люминесценция) таких белков при экспрессии в клетках млекопитающих была ниже, чем при коэкспрессии отдельных плазмид, кодирующих люциферазу и гиспидин-гидроксилазу. Этот эффект наблюдался как при добавлении гиспидина, так и при добавлении люциферина, что говорит о снижении активности как минимум люциферазы в составе белка слияния. Также мы получили препарат гиспидин-гидроксилазы и продемонстрировать его ферментативную активность in vitro. Таким образом, в результате выполнения отчетного этапа проекта мы описали и экспериментально подтвердили путь биосинтеза люциферина высших грибов из кофейной кислоты и продемонстрировали возможность переноса соответствующего каскада в эукариотический организм. Добавление в этот каскад ранее изученных генов биосинтеза кофейной кислоты из тирозина позволит создать генетически кодируемую автономную биолюминесцентную систему, не требующую для свечения добавления экзогенного люциферина. Результаты работы опубликованы в журнале PNAS: https://www.pnas.org/content/pnas/115/50/12728.full.pdf.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Целью отчетного этапа было получение полностью автономных биолюминесцентных организмов, не требующих для свечения добавления экзогенного люциферина, на примере дрожжей Pichia pastoris. Для этого мы выбрали гены, отвечающие за биосинтез кофейной кислоты из тирозина (кумароил-3-гидроксилазу и тирозин-аммоний-лиазу), оптимизировали их нуклеотидную последовательность, клонировали и коэкспрессировали вместе с генами биолюминесцентной системы грибов (люциферазой, гиспидин-3-гидроксилазой, гиспидинсинтазой, фосфопантетеинилтрансферазой). В результате мы получили штамм дрожжей, демонстрирующий устойчивую незатухающую люминесценцию, видимую невооруженным глазом, при культивировании в стандартных для Pichia pastoris условиях. Также мы показали, что обнаруженный нами ранее ген CPH действительно кодирует каффеоил-пируват-гидролазу - фермент, который замыкает цикл кофейной кислоты, превращая оксилюциферин в кофейную кислоту. Также мы провели предварительные эксперименты по переносу биолюминесцентной системы грибов в клетки млекопитающих. Клеточная линия HEK293NT, временно трансфицированная плазмидами, кодирующими гены люциферазы, гиспидин-3-гидроксилазы, гиспидинсинтазы и фосфопантетеинилтрансферазы, демонстрировала хорошо детектируемую люминесценцию в ответ на добавление кофейной кислоты. Таким образом, биолюминесцентная система грибов может использоваться для имиджинга лабораторных млекопитающих, в том числе для создания полностью автономных биолюминесцентных раковых клеточных линий и перевиваемых опухолей.