Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В ходе выполнения работ первого года исследований проводились работы по выяснению базовых механизмов контроля ветвления корневой системы у овоще-бахчевых культур непосредственно в меристеме родительского корня, а также механизмов солеустойчивости у дикого риса в сравнении с модельным объектом Spartina anglica. Изучение генетических факторов, контролирующих начальные этапы ветвления корня проводилось на примере кабачка (Cucurbita pepo), дыни (Cucumis melo) и огурца (Cucumis sativus). С использованием генетических баз данных (GenBank, www.ncbi.nlm.nih.gov; Phytozome, phytozome.jgi.doe.gov; Cucurbit Genomics Database, www.icugi.org; PlantTFDB, planttfdb.cbi.pku.edu.cn) в геномах кабачка и дыни были обнаружены ортологи гена MAKR4 Arabidopsis thaliana – CpMAKR4 и CmMAKR4, соответственно. При идентификации ортологов гена GATA23 был применен анализ генома огурца и идентифицированы 25 генов семейства GATA. Впервые был выполнен сравнительный филогенетический анализ ДНК-связывающего домена генов GATA Arabidopsis и огурца. Гены GATA огурца, также как и у Arabidopsis, по этому признаку можно разделить на четыре класса, из которых наиболее крупными являются классы А и В. С использованием ресурса CucurbiGene (cucurbigene.upv.es) впервые была определена нуклеотидная последовательность промотора гена кабачка CpMAKR4. Проведено клонирование промотора CpMAKR4 в вектор 369_pENTRattL4attR1_BS с последующим секвенированием вставки. Аналогичным образом клонировали промоторы корнеспецифичных генов GATA огурца CsGATA9.3, CsGATA9.4 и CsGATA12. Для флуоресцентного мечения ядер клеток был создан новый маркерный генетический конструкт на базе вектора системы клонирования Gateway 236 pKGW-RR-MGW, содержащий кассету pUBQ10::Venus-H2B-T35S. Данная кассета содержит ген флуоресцентного белка VENUS, слитый с геном человеческого гистона H2B, под промотором гена убиквитина A. thaliana (pUBQ10) и позволяет проводить прижизненную и постфиксационную локализацию ядер клеток на протяжении всех фаз клеточного цикла, включая митоз. Перечисленные действия являются подготовительным этапом для локализации экспрессии MAKR4 и GATA у кабачка и дыни в ходе инициации бокового корня. Были определены полные кодирующие нуклеотидные последовательности генов CpMAKR4 и CmMAKR4. С целью определения уровня экспрессии CpMAKR4 и всех 25 генов семейства GATA огурца в тканях корня были сконструированы праймеры и зонды для проведения ПЦР в реальном времени. В результате были выявлены корнеспецифичные гены GATA огурца – CsGATA9.3, CsGATA9.4 и CsGATA12. Для манипуляции уровнем экспрессии генов CpMAKR4, CsGATA9.3, CsGATA9.4 и CsGATA12 в корнях соответствующих растений были получены фрагменты кодирующей последовательности. Проведено их клонирование в вектор pK7GWiWGIID, предназначенный для РНК-интерференции. Данные работы являются подготовительным этапом для получения трансгенных корней тыквенных, несущих целевые вставки для подавления экспрессии ортологов генов MAKR4 и GATA23 у Тыквенных. За отчетный период 2016 года также проведены работы по изучению механизмов солеустойчивости у Oryza coarctata по сравнению с модельным объектом Spartina anglica и малоизученным видом Urochondra setulosa. Дикий галофитный вид Oryza coarctata является основной моделью для изучения механизмов солеустойчивости и единственным потенциальным источником генов, связанных с солеустойчивостью. Этот механизм включает целый комплекс структурных и физиологических факторов, которые обычно подразделяют на 3 основные категории: (1) осмотическая устойчивость, (2) изоляция ионов, включающая выделение из листа и/или изоляция в вакуоли, (3) блокировка транспорта ионов в/из корня. Исследование было проведено на всех трех уровнях. Анализ особенностей газообмена показал высокий потенциал адаптации к засолению фотосинтетического аппарата O. coarctata, S. anglica и U. setulosa. Ионный гомеостаз клетки исследованные виды поддерживают за счет накопления осмотически активных веществ, состав которых различается. У S. anglica и U. setulosa повышается синтез пролина и глицин-бетаина, однако у O. coarctata основным осмолитом является пролин, глицин-бетаин не синтезируется. При этом у S. anglica и U. setulosa повышается экспрессия холин-монооксигеназы и бетаиновой альдегид-дегидрогеназы, участвующих в биосинтезе глицин-бетаина, в то время как у O. coarctata эти ферменты не экспрессируются. Основным механизмом развития солеустойчивости O. coarctata, S. anglica и U. setulosa является эффективная секреция ионов натрия и хлора через солевыводящие железки. Нами впервые показано наличие солевых секреторных структур у O. coarctata. Данные настоящего исследования полностью опровергают общепринятую модель, согласно которой основным механизмом изоляции соли у этого вида является выведение ионов натрия и хлора через многочисленные волоски, покрывающих адаксиальную поверхность листа. Железки O. coarctata имеют уникальную для злаков анатомию – они одноклеточные. Согласно нашим результатам по анализу ультраструктуры, механизм выведения ионов из секреторной клетки у O. coarctata аналогичен таковому у S. anglica и предполагает трансмембранный перенос ионов в апопласт, однако ультраструктурные основы этого процесса различаются. Нами показано более раннее развитие апоплазматических барьеров в кончике корня при засолении у всех трех видов. Более раннее прекращение тока по апопласту можно считать адаптивной стратегией. Впервые показано значительное накопления феруловой кислоты в клеточных стенках коры кончика корня в ответ на засоление, однако остается неизвестным влияет ли феруловая кислота на проницаемость клеточных стенок, что должно быть изучено дополнительно. Изучение двух мутантных линий Oryza sativa CslF6 (Cellulose Synthase-Like F6), у которых нарушен биосинтез (1,3; 1,4)-β-D-глюкана, свидетельствует, что состав клеточной стенки влияет на солеустойчивость растения, однако механизм этого эффекта остается неизвестным. Выбранная нами модель является перспективной при изучении роли клеточных стенок в развитии солеустойчивости.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Ауксин-регулируемый транскрипционный фактор GATA23 принято считать первым молекулярным маркером при спецификации клеток основательниц (founder cells) примордия бокового корня у Arabidopsis [De Rybel et al., 2010. Current Biology. 20: 1697-1706]. В процессе выполнения исследований за отчётный период у огурца и кабачка произведён поиск генов-кандидатов на роль ортолога гена GATA23 Arabidopsis. Нами найдены все гены семейства GATA у огурца и кабачка. Проведён анализ уровня экспрессии этих генов в ответ на обработку корней огурца и кабачка экзогенным ауксином и его аналогами. В результате работ нами идентифицированы кандидаты на роль ортолога GATA23 Arabidopsis – CsGATA5.1, CsGATA15.2 у огурца и CpGATA15.2 у кабачка. Также изучен тканевой паттерн активности промотора гена MEMBRANE ASSOCIATED KINASE REGULATOR4 (MAKR4) в корне кабачка (pCpMAKR4). MAKR4 является ключевым геном, обеспечивающим переход клеток-основательниц к формативным делениям и инициации бокового корня у Arabidopsis. Выявлено, что CpMAKR4 начинает экспрессироваться в клетках протоксилемы на удалении в среднем 300 мкм от инициалей перицикла, что предваряет первые антиклинальные деления при инициации бокового корня у кабачка. Сравнительный анализ паттернов экспрессии CpMAKR4 и максимумов ответа на ауксин показал, что смещение максимума ответа на ауксин в клетки протоксилемы может совпадать с началом экспрессии CpMAKR4. Важно, что активность CpMAKR4 сохраняется в клетках периферической ксилемы и примордиях бокового корня до их выхода на поверхность корня. Кроме того, нами проведен функциональный анализ ортолога MAKR4 у кабачка – изучено изменение уровня экспрессии этого гена в ответ на обработку корней экзогенными ауксинами. Уровень экспрессии гена CpMAKR4 достоверно повышался при обработках 5 мкМ индолилмасляной кислотой и 10 мкМ нафтилуксусной кислотой. При обработке корней индолилуксусной кислотой уровень экспрессии гена CpMAKR4 не изменялся. Также получены первичные данные анализа манипуляции уровнем экспрессии CpMAKR4 в корне кабачка для определения его роли при инициации бокового корня. Все полученные нами данные убедительно показывают, что основные молекулярно-генетические механизмы формирования компетенции клеток материнского корня к образованию примордия бокового корня эволюционно стабильны и сходны у растений, различающихся по месту инициации бокового корня: в меристеме родительского корня или на значительном удалении от кончика корня – в зоне дифференциации. Также нами были исследованы механизмы солеустойчивости O. coarctata, S. anglica и U. setulosa, которые принадлежат к разным эволюционным линиям злаков. На основе анализа параметров газообмена и транспирации, эффективности использования воды, содержания фотосинтетических пигментов и ферментов, изотопного состава углерода, накопления и распределения ионов калия и натрия, осмолярности тканей листа было доказано, что три вида злаков устойчивы к засолению в поддержании функции фотосинтеза и водного баланса, что свидетельствует об эффективности механизмов солеустойчивости у трех злаков. Основными механизмами солеустойчивости являются секреция соли через солевыводящие железки и накопление осмолитов в тканях листа. Однако доказано существование эволюционных различий в становлении механизмов солеустойчивости в линиях злаков, представителями которых являются O. coarctata, S. anglica и U. setulosa. Лабильность механизмов солеустойчивости заключается в различии состава и уровня накопления осмолитов (пролина и глицин-бетаина), включая экспрессию ферментов, участвующих в их синтезе, а также различий в структуре секреторной системы, которые касаются распределения, анатомии и ультраструктуры солевыводящих железок. При этом показано существование разных онтогенетических программ развития и становления солевыводящей функции в процессе развития листа. За отчетный период было завершено изучение структурных особенностей секреторного аппарата у трех модельных видов злаков. Обнаружены принципиальные различия в клеточных механизмах секреции, а также в онтогенетических программах их становления. Однако анализ результатов дает основания предполагать, что основные молекулярные аспекты секреции схожи. Для всех структурных типов секреторных систем предлагается следующая модель солевыведения. Выделение соли в субкутикулярную полость осуществляется по апопласту путем сплошного потока под давлением, которое создается в результате поступления воды в области высокой концентрации ионов. Основную роль в активном энергозависимом переносе ионов соли в апопласт играют контакты ретикулярных элементов с плазмалеммой у O. coarctata и S. anglica и плазмалемма у U. setulosa. Для подтверждения этой гипотезы необходимо изучение экспрессии и локализации трансмембранных переносчиков ионов натрия и калия.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
За отчётный период был изучен тканевой паттерн активности промотора гена транскрипционного фактора CpGATA24 кабачка, ортолога GATA23 Arabidopsis. Анализ трансгенных корней кабачка несущих CpGATA24::mNeonGreen-H2B с применением лазерной сканирующей конфокальной микроскопии показал, что экспрессия гена активируется сначала в ряду клеток протоксилемы. Далее от кончика корня экспрессия GATA24 активируется в перицикле в клетках предшественницах бокового корня (founder cells), а затем в клетках эндодермы и стелярной паренхимы, вовлекаемых в развитие примордия. Важно, что, в отличие от AtGATA23 у кабачка активность промотора ортолога сохраняется и между развивающимися примордиями в клетках протоксилемы, метаксилемы и ее обкладки. Также были завершены работы по манипуляции уровнем экспрессии мебранно-ассоциированного киназного регулятора CpMAKR4 с целью выяснения роли этого гена в инициации бокового корня в корне кабачка. Показано, что корни не способны развиваться из трансгенного каллуса, в клетках которого подавление экспрессии гена CpMAKR4 происходит больше чем на 80%. Этим можно объяснить отсутствие изменений в развитии примордиев бокового корня и плотности боковых корней у полученных трансгенных RNAi растений. Следовательно, ген CpMAKR4 непосредственно вовлечен в регуляцию начальных этапов инициации бокового корня кабачка. Проведен анализ ко-локализации паттерна максимума клеточного ответа на ауксин и доменов активности промоторов наиболее ранних генов, регулирующих инициацию бокового корня у кабачка CpMAKR4 и CpGATA24. Это позволило определить роль ауксина в активации экспрессии CpMAKR4 и CpGATA24 при ветвлении корневых систем в семействе Тыквенные. С целью поиска новых генов, участвующих в регуляции ветвления корня, был проведён первичный биоинформационный анализ результатов секвенирования транскриптомов зон корня кабачка: зоны инициации примордиев боковых корней и зоны дифференциации между примордиями боковых корней. На основании результатов, полученных в ходе выполнения проекта, представлена модель эволюционного становления зон инициации бокового корня в разных группах цветковых растений. Также итогом работ стало подтверждение общих среди цветковых растений генетических механизмов запуска деления специфических клеток перицикла, приводящих к инициации бокового корня. Выявленные ключевые регуляторы инициации бокового корня CpMAKR4 и CpGATA24, могут послужить основой для направленного селекционного процесса с получением устойчивых форм Тыквенных с высоким адаптивным потенциалом. За отчетный период также было закончено исследование механизмов солеустойчивости Oryza coarctata, Spartina anglica и Urochondra setulosa, которые принадлежат к разным эволюционным линиям злаков. На основе элементного анализа тканей листа и тканевой и внутриклеточной компартментации избытка ионов натрия и хлора показана эффективность изоляции токсичных ионов в вакуолях и их полное отсутствие в цитоплазме. Различия в тканевой локализации связаны, скорее всего, с типом фотосинтеза. С целью выявления видов сем. Poaceae, способных к секреции соли, были протестированы механизмы солеустойчивости 73 видов из разных филогенетических линий злаков, включая 24 вида рода Oryza (36 линий и сортов, 8 геномов). Показано, что большинство из исследованных злаков устойчивы к засолению (за исключением 23 видов Oryza и 3 видов трибы Paniceae), из них 22 вида (все из подсем. Chloridoideae и Oryza coarctata из подсемейства Oryzoideae) активно выводят соль. Анализ анатомии эпидермальных структур изученных галофитов свидетельствует о существовании двух разных эволюционных линий становления солевыводящей функции у злаков. В кладе PACMAD четко прослеживается линия эволюции двуклеточных железистых структур, а в кладе BOP – одноклеточных железистых структур у единственного представителя – Oryza coarctata. Таким образом, две клады кардинально различаются по анатомическим предпосылкам для становления и эволюции солевыводящей функции. Это подтверждает, что любые генетические манипуляции, направленные на повышение солеустойчивости сельскохозяйственно-значимых злаков, должны в первую очередь учитывать положение вида в системе семейства и наличие предсуществующих параметров для развития механизмов устойчивости к соли.