Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Рецептор с-Met, известный также как фактора роста гепатоцитов (HGFR), относится к семейству трансмембранных тирозинкиназных рецепторов, регулирующих многие важные клеточные процессы, в том числе пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток.. Рецептор с-Met служит мишенью для терапии, необходимость в которой возникает при решении задач регенеративной медицины. Активация c-Met экзогенным лигандом может быть использована для ускорения процессов регенерации печени и мягких тканей. Природным агонистом с-Met в организме млекопитающих является фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor, HGF) . Основной проблемой при использовании очищенного экзогенного HGF в регенеративной медицине является короткое время жизни в кровяном русле, не превышающее 3-5 минут (Kawaida et al., 1994). Использование же ДНК-вакцин ограничено потенциальными канцерогенными и аутоиммунными эффектами. Другой проблемой терапевтического использования HGF является сложность его структуры. Функционально активный HGF предусматривает конформацию, содержащую 20 дисульфидных связей. В связи с этими трудностями, несмотря на то, что экспериментальное изучение потенциала HGF в регенеративной медицине стартовало в 1980-х гг, к фазе в клинических испытаний перешли только в 2014. Между тем, другим природным агонистом с-Met является белок InlB, фактор патогенности грамположительной бактерии L. monocytogenes. Взаимодействие InlB с с-Met активирует сигнальные события, включая активацию PI3K- и MAPK-зависимых сигнальных путей, что в ходе инфекции вызывает перестройки цитоскелета и индукцию фагоцитоза. Ряд работ показывает, что InlB и HGF не являются конкурентными агонистами и связываются с разными доменами c-Met (Shen et al., 2000). Потенциал InlB как терапевтического агента, ускоряющего процессы пролиферации и регенерации, усиливается тем, что бактериальный белок InlB не имеет структурного сходства с HGF, что предполагает отсутствие потенциальных аутоиммунных реакций, а также не требует пост-трансляционных модификаций, что значительно упрощает получение очищенного препарата in vitro. Ранее нами было установлено существование природной вариабельности InlB, определяющей эффективность инвазии листерий )Zaytseva et al., 2007; Adgamov et al., 2012). В рамках данной работы была поставлена цель оценить эффективность природных вариантов InlB в роли фактора, влияющего на пролиферацию эпителиальных клеток через активацию рецептора c-Met. Использование структурных вариантов, отличающихся по степени активации рецептора с-Met, позволит оптимизировать использование InlB как агониста c-Met, что в будущем может быть использовано в терапевтических целях для разработки средства, ускоряющего процессы регенерации определенных типов тканей человека. В результате работ, проведенных на 1 году выполнения проекта было впервые продемонстрировано существование различий между природными вариантами белка L. monocytogenes InlB в эффектах на пролиферацию клеток, перестройки цитоскелета и активацию сигнальных путей, контролируемых тирозинкиназным рецептором с-Met и киназами Mek/Erk1/2 (Чаленко и др., принято в печать). Для достижения этих результатов были получены очищенные препараты интерналиновых доменов 4х вариантов c-Met-связывающего, так называемого «интерналинового» домена InlB. Анализ различий между вариантами выявил 15 вариабельных сайтов (Собянин и др. 2016, http://www.kgau.ru/vestnik/2016_6/content/10.pdf ). In silico анализ показал, что различия могут влиять как на 3D структуру интерналинового домена, так и на связывание дополнительных до сих пор не идентифицированных эукариотических факторов (Sobyanin et al., на повторнгм рассмотрении в печати). Экспрессия вариантов в составе полноразмерных белков InlB в штамме L. monocytogenes с делецией гена inlB, показало, что природные варианты интерналинового домена InlB определяют тяжесть инфекции в зависимости от способа инфицирования: внутривенно, внутрибрюшинно, внутригастрально (Sobyanin et al., на повторнгм рассмотрении в печати) - что привело нас к гипотезе, что взаимодействие интерналинового домена InlB с c-Met может влиять на продукцию интерферона I типа IFN-beta, определяющего тяжесть течения инфекции в зависимости от способа инфицирования. Выдвинутая гипотеза и предполагаемые различия в эффекте на продукцию IFN-bets природными вариантами интерналинового домена InlB должны быть проверено. Все изученные варианты интерналинового доменаInlB ускоряли пролиферацию клеток человека HEp-2 и HUVEC и мыши C26, вызывали перестройки цитоскелета (Чаленко и др., принято в печать; Чаленко и др., готовится к публикации)). Был выделен вариант, оказывающий максимально выраженный эффект на пролиферацию и активацию MEK/Erk1/2 сигнального пути, а также вариант, показывающий наименьший эффект во всех тестах. Изучение доззависимости эффектов показало, что увеличение дозы выше 500 нг/мл приводит к цитотоксическим эффектам как на иммортализованных клетках, так и на нормальных. Большая часть плолученных данных или опубликована (Собянин и др., 2016, http://www.kgau.ru/vestnik/2016_6/content/10.pdf), или принята в печать (Чаленко и др., Molecular genetics, Microbiology and Virology; Chalenko et al., International Journal of Medical Microbiology http://events.conventus.de/index.php?eID=tx_nawsecuredl&u=0&g=0&t=901471614497&hash=736c2c93f2b55c05645ad4c4d60ed5a202fa784c&file=fileadmin/_newsletter/DGHM2016_Abstractband.pdf) либо находится на повторном рассмотрении (Sobyanin et al., FEMS Microbiology Letters) или первичном рассмотрении (Sobyanin et al., PLOS One). Оставшиеся данные готовятся к печати и будут поданы в ближайшее время. В целом, полученные в этом году данные позволили выявить варианты InlB, максимально эффективные в отношении с-Met-зависимых сигнальных путей, контролирующих пролиферацию эукариотических клеток, что являлось целью этапа и что позволяет перейти к следующим этапам выполнения следующих задач проекта.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Регенерация печени основана на пролиферации гепатоцитов и мезенхимальных клеток печени. Этот процесс зависит от тирозинкиназного рецептора c-Met. Гиперэкспрессия лиганда c-Met, фактора роста гепатоцитов HGF уменьшает острое повреждение печени через активацию сигнальных путей Erk1/2 и PI3K/Akt/mTor. Белок InlB, секретируемый грамположительной патогенной бактерией Listeria monocytogenes, необходим во время инфекции. InlB взаимодействует с c-Met через специфический домен, обозначаемый InlB321. Ранее было показано, что очищенный InlB321 может индуцировать митогенные и мотогенные эффекты в клетках, на поверхности которых находится c-Met. Недавно, мы описали несколько различающихся природных вариантов InlB321 (Adgamov et al., 2012). В рамках 1ого года выполнения проекта мы показали, что природные варианты InlB321 обладают различным потенциалом как в отношении поддержания инфекции, так и в отношении митогенных и мотогенных эффектов на культуры клеток (Sobyanin et al., 2017; FEMS Microbiolo Lett; Чаленко и др., 2017, Мол Ген Микробиол и Вирусол). В частности, InlB321 активируют необходимые для регенерации MAPK и Akt-зависимые пути (Chalenko et al., 2018, Arch Der Res, in press). В рамках 2ого года проекта мы выбрали вариант InlB321, отличающийся максимальной активностью in vitro при минимальных побочных эффектах, InlB321/15, и показали, что InlB321/15 обладает регенеративной активностью при остром химическом повреждении печени (Chalenko et al., 2018) , а также и гепатопротективной активностью. В частности, InlB321/15 уменьшает время полного восстановления макроскопических показателей печени и биохимии крови после интрагастрального введения CCl4. Кроме того, гистологическое исследование показывает уменьшение очагов некротических поражений печени на 17 %. Наконец, регенеративный потенциал InlB321/15 как средства для регенерации мягких тканей протестирован на модели скарифицированных ран. Показано достоверное уменьшение времени 50 % и полного заживления раны(Chalenko et al., 2018, Arch Der Res, in press). В целом, полученные результаты свидетельствует о потенциале InlB321/15 как средства для ускорения регенерации мягких тканей.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Общей целью проекта было получение данных о возможности использования InlB321, фрагмента бактериального белка InlB, специфически взаимодействующего с рецептором фактора роста гепатоцитов c-Met, для ускорения регенерации печени. В ходе работ III года выполнения проекта было показано, что отобранный нами в ходе работ I года вариант InlB321/15 попадает в целевой орган – печень, - но не накапливается в нем, что, в принципе, является положительным моментов, так как исключение возможности депонирования исключает возможность канцерогенных эффектов. Далее, в ходе выполнения экспериментальных работ было доказано, что InlB321/15 оказывает регенеративный эффект, приводящий к ускоренному восстановлению печени. Так, оценка массы печени животных через неделю после резекции печени достоверно показала, что животные, получавшие лечение препаратом InlB321/15 (трижды за неделю, внутривенно в концентрации 2 нг/г) восстановили ткань печени на 73,07% от исходного уровня, в контрольной группе этот показатель составил 30,5%. Микроскопическом исследовании препаратов печени подтвердило наличие более выраженных признаков характерных для регенеративных процессов в печени животных получавших лечение. В ходе проведения физико-химических исследований, ставивших цель исследовать гипотезу о лучшей димеризации варианта InlB321/15 как основы его высокой мотогенной и митогенной активности, эта гипотеза была отвергнута. Вместе с тем было выявлены отличия между вариантами в ряде физико-химических параметров. В частности, был показан более высокий квантовый выход флюоресценции варианта InlB321/15, свидетельствующий о возможных сдвигах в позиции и/или окружении триптофана в положении 124. Учитывая, что Trp124 вовлечен в непосредственное взаимодействие с c-Met, эти сдвиги, предположительно, лежат в основе более высокой функциональной активности InlB321/15 по сравнению с другими вариантами. Кроме того, показаны различия во времени элюции, отличающие вариант InlB321/13, найденный в типовом лабораторном штамме EGDe, от других вариантов. Эти различия, свидетельствующие о более развернутой конформации данного варианта, могут объяснять отсутствие у него мотогенной активности и низкую митогенную активность. Показано, что помимо возможной вариабельности во взаимодействии с рецептором c-Met, функциональные различия вариантом могут быть связаны со взаимодействием с другими рецептором, находящимся на поверхности клеток млекопитающих и человека – белком gC1q-R. В частности, более высокая функциональная активность InlB321/15 коррелирует с более высокой эффективностью связывания с gC1q-R. По результатам выполнения проекта представлено два доклада на международных конференция. На 5й конференции TERMIS, проходившей под лозунгом “Integration of Industry, Government, and Academia for Regenerative Medicine,” представлен постерный доклад The c-Met agonist of the bacterial origin Internalin B accelerates regeneration of soft tissues. На конференции MedVet Pathogens Прато Италия 5-8 октября 2018, представлен устный доклад Comparative study of natural variants of Listeria monocytogenes invasion factor InlB: biological and physical aspects. В этом году вышла статья в журнале Q1 Archives of Dermatological Research и еще три статьи поданы в печать.