Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Текущий этап выполнения НИР по гранту РНФ № 25-25-20601 был посвящен исследованию цитотоксических свойств потенциальных агонистов рецептора, ассоциированного со следовыми аминами-1 (TAAR1) - новых структурно-модифицированных аналогов тиронаминов. Исходные структурные аналоги тиронаминов были предоставлены организацией-партнёром – Международной межправительственной научно-исследовательской организацией "Объединенный институт ядерных исследований" (ОИЯИ). В ОИЯИ были выполнены исследования физико-химических свойств синтетического аналога тиронамина Т0АМ. Химическое строение тиронамина подтверждено методом ЯМР-спектроскопии. Методом термогравиметрического анализа установлено, что начальная температура основной потери массы СА-Т0АМ вследствие разложения составляет 180 °С. Результаты исследования СА-Т0АМ методом порошковой рентгеновской дифракции указывают на его кристалличность и отсутствие в образце аморфной фазы. Определены характеристики (максимумы поглощения и молярные коэффициенты экстинкции) электронных спектров СА-Т0АМ в ацетонитриле. Особенности молекулярной динамики СА-Т0АМ в виде дигидрохлорида исследовали методом ИК-спектроскопии в диапазоне 4000–400 см-1. Отличительной особенностью колеба¬тельного спектра является проявление в нем пиков резонанса Ферми (2576 и 2650 см-1), обусловленных наличием в структуре дигидрохлорида СА-Т0АМ взаимодействий –NH3+…Cl–. В результате исследования кислотно-основных свойств СА-Т0АМ установлено, что в диапазоне физиологических значений pH (6,9 ÷ 7,2) будет преобладать монопротонированная форма СА-Т0АМ (протонирование по амино-группе, связанной с алкильным фрагментом молекулы). Для нейтральной и монопротоированной форм СА-Т0АМ выполнена оптимизация молекулярной геометрии и расчет параметров электронного строения с использованием метода DFT (уровень теории B3LYP/6-31G(d,p)) с учетом неспецифической сольватации диметилсульфоксидом в рамках модели РСМ. С использованием полученных равновесных геометрий объектов выполнен расчет структурных дескрипторов СА-Т0АМ для дальнейшего исследования его реакционной способности комплементарными экспериментальными методами и методами молекулярного моделирования. Для оценки цитотоксичности перспективных лигандов TAAR1-рецепторов на базе ИНВХ им. В.К.Гусака была осуществлена инкубация различных клеточных линий в присутствие различных концентраций перспективных лигандов TAAR1 с последующим определением количества живых и мёртвых клеток методом дифференциального окрашивания красителем трипановым синим (светлопольная микроскопия). Оценка метаболической активности осуществлялась методом МТТ (спектрофотометрия). Оценка апоптоза осуществлялась цитохимическим методом, путем определения аннексина V, меченного флуоресцентным красителем (annexin V-FITC). Цитотоксичность оценивали на пяти клеточных линиях: 1. Фибробласты кожи человека (собственная линия); 2. Астроглия из мозга нелинейной белой крысы (собственная линия); 3. Neuro-2a (коллекционная линия, нейробластома мыши); 4. THP-1 (коллекционная моноцитоподобная линия, острый моноцитарный лейкоз человека); 5. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки из костного мозга нелинейной белой крысы. Концентрации синтетического аналога тиронамина для экспериментальной оценки цитотоксического профиля исследуемого препарата in vitro были выбраны а основании анализа литературных данных о цитотоксичности лигандов TAAR1, и составили 20, 50, 200 и 400 микромоль (мкМ). Были определены основные механизмы цитотоксического действия СА-Т0АМ при высоких концентрациях. По данным МТТ-анализа, нарушение метаболической активности при концентрации СА-Т0АМ 400 мкМ инициируется достаточно быстро, предшествуя массовой гибели клеток (снижение жизнеспособности по трипановому синему). Последующее снижение жизнеспособности тесно коррелирует с ростом уровня апоптоза, что свидетельствует о преобладающем механизме клеточной гибели через программированную смерть. Обнаружены различия в чувствительности к СА-Т0АМ между клеточными линиями. Фибробласты кожи и ММСК продемонстрировали наибольшую устойчивость к СА-Т0АМ. Наиболее чувствительными к СА-Т0АМ оказались линии Neuro-2a и THP-1. Клетки астроглии продемонстрировали промежуточную чувствительность к СА-Т0АМ. Выраженная цитотоксичность наблюдалась только при 400 мкМ (снижение жизнеспособности на 11,2% к дню 3). Определены предельно допустимые концентрации синтетического аналога Т0АМ методом подбора концентраций, при которых не наблюдаются цитотоксические эффекты (относительно контроля). Концентрация 20 мкМ может быть охарактеризована как условно безопасная для дальнейших исследований. Концентрация 50 мкМ показала пограничный эффект, вызывая выраженный апоптоз на некоторых линиях (Нейро-2а, THP-1) к дню 7 и 14, но сохраняя высокую жизнеспособность, что также указывает на ее перспективность для изучения в определенных условиях.