Разработка биоматериалов нового поколения путем криогенного структурирования продуктов ферментативного гидролиза децеллюляризованной печени для тканевой инженерии и регенеративной медицины

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 25-25-00425

НазваниеРазработка биоматериалов нового поколения путем криогенного структурирования продуктов ферментативного гидролиза децеллюляризованной печени для тканевой инженерии и регенеративной медицины

Руководитель Басок Юлия Борисовна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации , г Москва

Конкурс №102 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-405 - Регенеративная медицина

Ключевые слова децеллюляризованная печень, криогенно-структурированный биополимерный материал, внеклеточный матрикс, клеточный носитель, тканевая инженерия, регенеративная медицина, персонализированная терапия

Код ГРНТИ34.03.37

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Ожидаемые результаты
В проекте предполагается разработать подходы к управлению функциональными свойствами материала на основе ДецПс методами криогенного структурирования и инкорпорирования VEGF. Ожидаемые результаты: 1. Установлено влияние протокола криогенного структурирования с использованием N-(3-диметиламинопропил)-N’-этил-карбодиимида (ЭДК) продуктов ферментативного гидролиза ДецПс на структуру, биомеханические и физико-химические свойства биодеградируемых макропористых материалов. 1.1 Отработаны методики ферментативного гидролиза пепсином ДецПс и криоструктурирования с использованием ЭДК. 1.2 Определен химический состав КриоДецПс (коллаген, гиалуроновая кислота, сульфатированные гликозаминогликаны, фибронектин и ламинин) и особенности структуры с применением биохимических методов, иммуноферментного анализа и сканирующей электронной микроскопии. 1.3 Охарактеризованы физико-химические свойства (биодеградация, набухание и модуль упругости) КриоДецПс. 2. Проведена дополнительная функционализация КриоДецПс путем включения в их состав биоактивной молекулы VEGF. 2.1 Определен профиль распределения VEGF в объеме КриоДецПс с использованием аналоговой технологии с меченным альбумином. 2.2 Изучен характер высвобождения VEGF из КриоДецПс в модельных условиях. 3. Установлены закономерности взаимодействия полученных КриоДецП с биологическими объектами. 3.1 Исследованы цитотоксичность на клеточной линии фибробластов NIH 3Т3 и гемосовместимость КриоДецПс in vitro. 3.2 Установлены уровни устойчивости КриоДецПс in vitro к воздействию протеолитических ферментов (коллагеназы, папаина). 3.3 Произведена оценка способности КриоДецПс к заселению мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани человека и клетками пупочной вены человека EA.hy926. 3.4 Изучены местное действие и биодеградация КриоДецПс in vivo при внутримышечной имплантации крысам. 4. Будет разработана методика формирования экспериментальных ТИК на основе КриоДецПс и клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2, высокодифференцированных и проявляющих многие функциональные особенности нормальных клеток печени. Мониторинг жизнеспособности клеток будет проведен методом селективного флуоресцентного окрашивания живых и мёртвых клеток (Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit Assay), оценка пролиферативной активности – методом колориметрического исследования митохондриальных дегидрогеназ (MTT тест), а также путем флуоресцентного измерения количества ядерной ДНК (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit). Для анализа морфологии образцов будут привлечены гистологические методы исследования. Количественная оценка функциональной активности ТИК будет проведена путем исследования метаболизма резазурина, секреции альбумина, образования мочевины (тест с нагрузкой хлоридом аммония). Кроме того, планируется определение экспрессии маркерных генов гепатоцитов методом ПЦР в реальном времени (изоформы цитохрома Р450 CYP1A2, альбумина и др.). Таким образом, комплексный подход к изучению влияния протокола криогенного структурирования на свойства ДецПс будет основан на сравнительной оценке структурных и функциональных особенностей, включая размер пор, модуль упругости, протеолитическую устойчивость, биосовместимость, способность к репопуляции клетками человека. Свойства изученных материалов будут дополнены способностью к индукции васкуляризации путем введения VEGF. Значение полученных результатов будет иметь прикладной характер, создавая задел для последующего развития клеточной терапии патологий печени, и обеспечит фундаментальные научные знания в установлении взаимосвязей между скоростью биодеградации, биомеханическими показателями и клеточным и тканевым ответом на разработанные материалы. Сформированные в ходе проекта ТИК также можно использовать для исследования гепатотоксичности и метаболизма разрабатываемых лекарственных веществ. Данные, которые будут получены в рамках данного проекта, будут опубликованы в виде научных статей в международных рецензируемых журналах, а также в ведущих отечественных журналах. Планируется, что основная часть полученных данных будет опубликована в журналах, входящих в квартиль Q1/Q2.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Целью первого этапа была разработка и оптимизация технологии получения криоструктуратов на основе производных децеллюляризованной печени свиньи (КриоДецПс), а также исследование их биохимического состава, морфологии, физико-химических свойств, гемосовместимости и цитотоксичности in vitro. Установлено, что оптимальным является ферментативный гидролиз ДецПс в растворе пепсина (2 мкг/мл) в 0,5 М уксусной кислоте при 22 °С в течение 24 ч, обеспечивающий разрушение частиц ДецПс. Показано, что наилучшие структурно-механические характеристики и распределение макропор достигаются при замораживании продукта ферментативного гидролиза ДецПс (20 мг/мл) при −20 °С в течение 24 ч с последующей криоэкстракцией льда холодным этанолом и химическим дублением спиртовым раствором N-(3-диметиламинопропил)-N’-этил-карбодиимида. С привлечением биохимических методов и иммуноферментного анализа было определено содержание ключевых компонентов внеклеточного матрикса в гидролизате ДецПс: фибриллярный коллаген — 98,8 ± 0,9 мкг/мг; сульфатированные гликозаминогликаны — 11,7 ± 0,8 мкг/мг; гиалуроновая кислота — 21,4 ± 2,3 нг/мг; фибронектин — 0,61 нг/мл; ламинин — 0,35 нг/мл. Сканирующая электронная микроскопия показала, что в образце с 20 мг сухого вещества /мл, присутствуют три класса пор: малые 20-60 мкм (31,4%), средние 60-100 мкм (37%) и крупные более 100 мкм (31,4%). Исследованы физико-химические свойства КриоДецПс, включая биодеградацию, набухание и модуль упругости. Показано, что материал демонстрирует низкую степень деградации в реактиве Фентона, имитирующем воспалительную реакцию организма на чужеродное тело (9,42% за 28 суток), высокую водопоглощающую способность (48,2 мл/г) и значительную долю макропор (80,7%), что свидетельствует о его перспективности для тканевой инженерии. Значение модуля упругости для образца, содержащего 20 мг ДецПс/ мл продукта ферментативного гидролиза ДецПс, составило 1,85 ± 0.27 кПа. Была отработана аналоговая технология инкорпорирования белков в КриоДецПс на модели FITC-меченого бычьего сывороточного альбумина (БСА). Постсинтетическая иммобилизация, минимизирующая химическую модификацию функциональных центров инкарпорированных молекул, обеспечила равномерное распределение FITC-меченого БСА без изменения структуры КриоДецПс. Было проведено инкорпорирование в материал фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) для стимуляции процессов неоваскуляризации после имплантации. Полученные данные показали двухфазный профиль высвобождения VEGF в фосфатном буфере (рН=7,0): быстрый выход несвязанных молекул в первые 4 ч, затем стабильное высвобождение (0,043 ± 0,007 нг/ч) в течение 68 ч. КриоДецПс представляется перспективным гемосовместимым биодеградируемым депо для VEGF. Была изучена гемосовместимость материалов in vitro. Относительная величина гемолиза составила менее 2% (0,34–0,65%), что соответствует критериям гемосовместимости. Также была исследована цитотоксичность материалов на клеточной линии фибробластов NIH 3Т3. Методом прямого контакта и при действии вытяжек установлено отсутствие цитотоксического влияния КриоДецПс на культуру фибробластов NIH 3Т3. Клетки сохраняли нормальную морфологию и жизнеспособность (при окрашивании Live/Dead Assay). Было опубликовано 2 статьи в международных журналах, индексируемых в Scopus и Web of Science. Достигнутые при выполнении проекта научные результаты были представлены на конференциях: XVII Российско-Китайский Симпозиум «Новые материалы и технологии» (18–22 августа 2025, Екатеринбург, Россия; стендовый доклад), VII Российский национальный конгресс с международным участием «Трансплантация и донорство органов» (15–17 сентября 2025, Москва; Россия, устное выступление).

Публикации

1. Белова А.Д., Немец Е.А., Гусева Е.А., Григорьев А.М., Басок Ю.Б., Севастьянов В.И. Cryogenically Structured Macroporous 3D-Scaffold for Tissue Engineering from Products of Enzymatic Hydrolysis Decellularized Liver Сборник трудов XVII Международного Российско-Китайского Симпозиума "Новые материалы и технологии", Vol. 1, p. 206-209 (год публикации - 2025)

2. Григорьев А.М, Басок Ю.Б., Кузнецова Е.Г., Белова А.Д., Новиков И.А., Суббот А.М., Кулакова В.К., Лозинский В.И., Севастьянов В.И. Криоструктурированный макропористый скаффолд для тканевой инженерии на основе продукта ферментативного гидролиза децеллюляризованной печени Материалы VII Российского конгресса с международным участием «Трансплантация и донорство органов», Том 27, №S, с. 146 (год публикации - 2025)
10.15825/1995-1191-2025-S-146

3. Онищенко Н.А., Шагидулин М.Ю., Ванюкова А.А., Кузьмина А.В., Никольская А.О., Волкова Е.А., Костышева А.И., Лычагин И.А., Казанцева К.А., Ибрагимова М.Р., Григорьев А.М., Пономарева А.С., Басок Ю.Б. Мезенхимальные стромальные клетки при хронических фиброзирующих заболеваниях печени: роль в патогенезе и при терапевтическом применении Вестник трансплантологии и искусственных органов, том 27, №4, с. 110-124 (год публикации - 2025)

4. Пономарева А.С., Баранова Н.В., Басок Ю.Б., Севастьянов В.И. Биомиметики внеклеточного матрикса для тканевой инженерии поджелудочной железы Вестник трансплантологии и искусственных органов, том 27, №3, с. 146-159 (год публикации - 2025)
10.15825/1995-1191-2025-3-146-159