Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Патогены рыб, способные вызывать заболевания у пресноводных и морских обитателей, представляют собой микроорганизмы из различных таксономических групп. В их число входят бактерии, вирусы, грибы и другие паразитические организмы. Изучение патогенов рыб имеет ключевое значение для развития аквакультуры, рыболовства и сохранения природных экосистем. В последние десятилетия наблюдается рост интереса к данной теме, что связано с увеличением объемов аквакультурного производства рыбы и морепродуктов, а также с ухудшением состояния водоемов и изменениями климата. Заболевания рыб могут приводить к значительным экономическим потерям, снижению продуктивности аквакультур и угрожать биоразнообразию в естественных водоемах. Понимание механизмов патогенеза, способов передачи инфекций и факторов, способствующих распространению заболеваний, является необходимым условием для разработки эффективных методов профилактики и лечения. Бактериальные заболевания представляют собой одну из основных угроз для продуктивности аквакультурных хозяйств и устойчивости природных экосистем. Инфекции могут приводить к значительным экономическим потерям из-за снижения продуктивности рыбоводства и качества продукции. Бактериальные патогены могут проникать в организм рыб через повреждения кожи или жабр, заражению способствуют стрессовые условия, такие как изменение температуры, низкий уровень кислорода или загрязнение воды. Патогенные бактерии могут выделять токсины, которые повреждают ткани и подавляют иммунный ответ хозяина. Некоторые бактерии способны образовывать биопленки, что затрудняет борьбу с инфекциями. Идентификация патогенов, вызывающих бактериальные заболевания, механизмов их патогенного действия и методов контроля являются ключевыми факторами для эффективного производства в аквакультуре. Цель проекта – создание тест-систем для диагностики основных бактериальных возбудителей аквакультурных рыб с использованием методов изотермической амплификации и многокомпонентных гибридизационных зондов на основе аптамерного ядра. В 2025 году в исследовании были определены консервативные и селективные участки генома патогенов, таких как Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescens, Yersinia ruckeri, Flavobacterium psychrophilum, Flavobacterium columnare и Vibrio anguillarum, а также верифицированы целевые участки для последующей детекции. Также была определена эффективность ДНК-наносенсоров с различными аптамерными ядрами. Оптимальным методом визуализации оказался аптамер DAP-10, обеспечивающий наивысший уровень сигнала к фону. Проверено влияние химической модификации дапоксила на интенсивность флуоресценции: все 10 модифицированных соединений обладают более низким уровнем флуоресценции, чем дапоксил. Эти модификации не станут основой работы в этом проекте, но будут полезны при использовании в других тест-системах, основанных на гашении сигнала. Также изучено влияние компонентов реакционного буфера на чувствительность сенсоров. В результате было установлено, что высокие концентрации pH снижают эффективность генерации сигнала. Увеличение концентрации олигонуклеотидов и красителя усиливает сигнал, а предварительная амплификация образца может снижать эффективность детекции, вероятно, из-за ингибирования сенсоров компонентами амплификационной смеси. Повышение температуры инкубации повышает чувствительность в 10 раз, что связано с возможностью использования более длинных аналит-связывающих фрагментов. В рамках исследования были проведены сравнительные эксперименты по эффективности различных методов амплификации ДНК (LAMP, DAMP, SDA, NASBA) в сочетании с ДНК-наносенсорами. Все полученные продукты амплификации были проанализированы с использованием бинарных сенсоров и многокомпонентных ДНК-наномашин. Результаты показали, что бинарные сенсоры без предварительного нагрева эффективно работают только с продуктами амплификации NASBA, в то время как ДНК-наномашины продемонстрировали универсальность и активность со всеми типами амплификационных продуктов. На основе анализа полученных результатов был выбран метод амплификации DAMP как наиболее устойчивый к контаминации, требующий минимального количества ферментов и менее склонный к ложноположительным результатам по сравнению с LAMP. Кроме того, были определены эффективность методов выделения нуклеиновых кислот из коллекционных образцов и образцов пораженных тканей инфицированных рыб, а также качество очищенной ДНК, что критично для дальнейшей амплификации с сипользованием различных методов. Создана тест-система для детекции A. hydrophila методом DAMP, которая показала возможность нахождения патогена в смывах и образцах пораженных тканей рыб, а также в образцах с различных участков установки замкнутого водоснабжения. Наиболее эффективным методом сбора образцов оказалось использование стерильных тампонов, что упрощает процесс транспортировки. Лизирование стенок бактерий в буфере и разрушение их шприцом или нагреванием оказалось достаточно для получения препаратов нуклеиновых кислот надлежащего качества и в достаточном количестве непосредственно на месте сбора образцов.