КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 25-14-00047
НазваниеПолногеномное исследование регуляторной роли некодирующих РНК и сетей их взаимодействий при моделировании ишемии и действии нейропротективных пептидов в культурах клеток человека
Руководитель Филиппенков Иван Борисович, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" , г Москва
Конкурс №104 - Конкурс 2025 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика
Ключевые слова Функциональная геномика, ишемический инсульт, клеточные модели ишемии, нейропротекция, регуляторные пептиды, пептидные препараты, транскриптомика, RNA-Seq, экспрессия генов, некодирующие РНК, микроРНК, циклические РНК, генные сети
Код ГРНТИ34.15.23
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Изучению архитектуры и иерархии регуляторных сетей в контроле биологических процессов у человека сегодня придается большое значение. Сети с участием РНК различных типов способны осуществлять контроль геномной активности и, таким образом, лежат в основе регуляторной иерархии биологических процессов в норме, при патологии и терапевтическом воздействии. К наиболее активным сетевым регуляторам относятся короткие микроРНК, а также ковалентно замкнутые молекулы РНК, кольцевые РНК, или как принято их называть - циклические РНК (циклоРНК). Ввиду повышенной метаболической устойчивости данные типы некодирующих РНК способны участвовать в контроле экспрессии многих генов и значимо влиять на поддержание архитектуры регуляторной сети. Кроме того, создание препаратов, нацеленных на некодирующих РНК, как узлы регуляторной сети, может стать ключом к повышению прецизионности, эффективности и безопасности методов лечения заболеваний.
В настоящем проекте мы предполагаем проанализировать сетевые взаимодействия на уровне некодирующих РНК на культурах клеток человека в условиях, моделирующих события острого церебрального инсульта, как одного из наиболее значимых многофакторных заболеваний. Также планируем изучить роль регуляторной сети в проявлении влияния пептидов, как нейропротекторов. В рассмотрение будут взяты синтетические производные адренокортикотропного гормона - пептидный препарат семакс (АКТГ(4-7)PGP) и инновационный пептид АКТГ(6-9)PGP. Данные пептиды зарекомендовали себя как физиологически активные и к тому же являются структурно близкими, что дает возможность провести наиболее точное сравнение их эффектов в зависимости от вариаций аминокислотной последовательности.
Решение поставленных в проекте задач будет основано на применении комплекса молекулярно-биологических, генно-инженерных и биоинформатических подходов, включая профилирование некодирующих РНК, идентификацию генных (РНК) сетей, кластеризацию элементов сети, а также верификацию и модуляцию активности осей сети, связанных с влиянием событий ишемического каскада и корректирующей активностью пептидов. Кроме того, репрезентативное сравнение результатов настоящего проекта на клеточных культурах человека с полученными нами ранее данных о профиле некодирующих и мРНК на модели tMCAO у крыс, позволит сформировать пул транскриптомных данных, обладающих максимальным потенциалом для трансляционной медицины ишемического инсульта.
На основании полученных результатов будет предложена концепция по применению свойств некодирующих РНК в качестве потенциальных биомаркеров или мишеней терапии инсульта. Более того, полученные данные создадут задел для разработки инновационных природоподобных лекарств на основе РНК и пептидов, включая персонифицированные алгоритмы их применения.
Ожидаемые результаты
Белок-кодирующие гены занимают около 1 процента общей протяженности ДНК человека, при этом более 90% генома человека транскрибируется с образованием некодирующих РНК. Роль многих из них неизвестна, но многие выполняют важные функции, в том числе обеспечивая регуляцию экспрессии генов в норме, при патологии и действии физиологически активных веществ. Более того, на некодирующие РНК обращают все большее внимание для создания тестовых систем биоматериала пациентов с большей прогностической силой, а также рассматривая их как мишени для терапии или даже в качестве самостоятельных лекарств. Особый интерес представляют короткие микроРНК, а также длинные ковалентно замкнутые молекулы циклических РНК (циклоРНК), обладающие повышенной метаболической стабильностью. Молекулы некодирующих РНК (циклоРНК, микроРНК) могут действовать в регуляторной взаимосвязи, контролируя экспрессию генов и воздействуя на функциональные свойства мРНК. Такая регуляция носит сетевой характер, потенциально распространяясь на масштабы полного генома, а кроме того повышенная метаболическая устойчивость циклоРНК играет особую роль в поддержании архитектуры регуляторной сети.
В настоящем проекте мы предполагаем комплексно проанализировать некодирующие РНК и сети их взаимодействий в регуляции экспрессии генов человека при моделировании событий ишемического каскада клеток мозга и нейропротективном влиянии инновационных препаратов на основе пептидов. Ишемический инсульт относится к числу наиболее распространенных и социально значимых заболеваний при крайней ограниченности средств его эффективного лечения, в особенности в стратегии восстановления функций нервных клеток. Концепция, основанная на использовании структур природных соединений, чтобы на их основе конструировать потенциальные противоинсультные лекарства, рассматривается сегодня наиболее многообещающей. В распоряжении коллектива имеется целая серия синтетических пептидов, обладающих нейропротективными свойствами. Ранее нами на экспериментальной модели ишемии мозга у крыс было показано, что пептиды АКТГ(4-7)PGP (семакс) и АКТГ(6-9)PGP способны вызывать изменения экспрессии генов, вовлеченных в процессы воспаления и синаптической передачи. Пептиды демонстрировали компенсаторное влияние, препятствующее вызванному патологией изменению транскрипционной активности генов, лежащее в основе их нейропротективных эффектов.
Безусловный интерес для дальнейшего развития стратегии нейропротекции при инсульте представляет понимание природы компенсаторного влияния пептидов и последовательностей биохимических реакций, которые запускаются пептидами в клетке при церебральной ишемии. Инсульт как многофакторное заболевание характеризуется полигенностью и сложной сетевой регуляцией патогенетического процесса на транскрипционном и посттранскрипционном уровне. Соединения пептидной природы, вероятно, способны вовлекаться в подобную регуляцию, в том числе, путем контроля активности сетей с участием некодирующих РНК в клетках мозга. Поэтому целью данного проекта является изучение роли некодирующих РНК и сетей их взаимодействий в патогенезе ишемического инсульта и в механизмах нейропротективного действия пептидов. Работа будет основана на использовании культур клеток нервной ткани человека. Данная модель в отличие от модели на животных существенно упрощает трансляцию результатов модельных исследований ввиду отсутствия межвидового барьера «животное-человек». Кроме того, клеточная система позволяет моделировать отдельные этапы ишемического каскада и упростить использование подходов генетической инженерии, столь необходимых для изучения функций генов и РНК в механизмах патогенеза и действия пептидов. Для достижения цели в работе будет использован широкий спектр экспериментальных и биоинформатических методов, включая постановку модели событий ишемии на клетках нервной ткани человека, сверхэкспрессию циклоРНК, трансфекцию малых РНК, создание репортерных конструкций, полногеномный RNA-Seq анализ, а также анализ больших баз геномных данных и кластерный анализ.
В проекте будут получены следующие основные результаты:
1) Будут найдены некодирующие РНК (циклоРНК, микроРНК), изменившие экспрессию под влиянием ишемии - событиях оксидативного стресса и воспаления - и воздействии пептидов (семакс и АКТГ(6-9)PGP) в линиях клеток нервной ткани человека в полногеномном масштабе.
2) Будет идентифицирована генная сеть и дискриминированы отдельные циклоРНК-микроРНК-мРНК оси, обеспечивающие реализацию активности циклоРНК и микроРНК в масштабах полного генома при моделировании событий ишемии клеток человека.
3) Будет охарактеризован вклад некодирующих РНК (циклоРНК и микроРНК) в реализации эффектов пептидов, включая природу их компенсаторных эффектов, при событиях ишемии с помощью сверхэкспрессии выбранных циклоРНК и микроРНК в культуре клеток человека и анализа экспрессии генов-мишеней. Кроме того, сопоставление данных с клеточного и организменного уровней (транскриптомные данные tMCAO из лабораторной коллекции) позволят сформировать пул транскриптомных данных, обладающих максимальным потенциалом для трансляционной медицины ишемического инсульта.
Результаты впервые позволят пролить свет на то, как организована регуляция процесса нейропротекции, запускаемая пептидами, на уровне функционирования некодирующих РНК и сетей их взаимодействий в клетках человека. На основании полученных данных будет предложена концепция по применению свойств отдельных некодирующих РНК в качестве потенциальных биомаркеров или мишеней терапии инсульта, а также в качестве потенциальных противоинсультных лекарств. Более того, полученные данные создадут задел для создания инновационных лекарств на основе РНК и пептидов и могут быть использованы в дальнейшем для определения индивидуальной тактики лечения инсульта с помощью соответствующих лекарственных воздействий, что значимо для развития подходов к терапии инсульта и персонифицированной и трансляционной медицины.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В отчётный период поставлена модель воспаления с использованием бактериального липополисахарида (ЛПС) на клетках микроглии человека HMC-3 и модель оксидативного стресса (ОС) на нейрональных клетках SH-SY5Y человека с применением пероксида водорода. Кроме того, была проведена оценка влияния пептидов на основе адренокортикотропного гормона – АКТГ(4-7)PGP (семакс) и его аналога АКТГ(6-9)PGP на воспалительный ответ клеток микроглии человека HMC-3 под действием ЛПС и на выживаемость клеток SH-SY5Y в условиях ОС.
Нами была поставлена модель воспаления на культуре клеток микроглии человека HMC-3. Активация клеток линии иммортализованной микроглии человека HMC3 под действием ЛПС может служить моделью ишемического нейровоспаления. Клетки культивировали в стандартных условиях в среде DMEM/F12, в том числе с введением пептидов семакса и его аналога АКТГ(6-9)PGP. Микроскопический анализ культуры клеток выявил характерное увеличение размеров клеток под действием ЛПС, которое было менее выражено под действием пептидов семакса и АКТГ(6-9)PGP в условиях воспаления. Кроме того, с помощью иммуноферментного анализа было проанализировано содержание цитокинов IL-1β и IL-6, как маркеров воспаления, в культуральной среде клеток НМС3, инкубированных с индуктором воспаления ЛПС, а также пептидами семаксом или АКТГ(6-9)PGP в условиях индукции воспаления в течение 7 часов. В этих условиях относительное содержание IL-1β и IL-6 под действием ЛПС возрастало в 1,5 и 2 раза, соответственно. Под воздействием семакса и АКТГ(6-9)PGP в культуре клеток HMC-3 в условиях индуцированного воспаления отмечалось достоверное снижение содержания анализируемых цитокинов.
Клетки линии SH-SY5Y являются одними из наиболее часто используемых в клеточных моделях ишемии. Для модели ОС нейрональные клетки человека SH-SY5Y культивировали в стандартных условиях в среде DMEM/F12. Выживаемость клеток оценивали с помощью МТТ-теста после введения различных концентраций пероксида водорода. В этих условиях увеличение концентрации пероксида водорода сопровождалось снижением количества живых клеток: 100 мкМ H2О2 снижало выживаемость клеток по сравнению с контролем на 20 % (до 80 ± 2,8 %), 200 мкМ – на 32 % (до 68 ± 5 %), 300 мкМ - до 56 ± 0,4 %. При микроскопическом исследовании в лунках, подвергнутых действию пероксида водорода (300 мкМ), отдельные клетки были прикреплены и распластаны. Остальные клетки имели округлую форму и окрашивались красителем трипановым синим, что свидетельствует о гибели клеток. Для дальнейшего исследования выживаемость клеток оценивали визуально с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 35. Были подобраны условия, при которых число клеток округлой формы через 16 - 18 ч после воздействия пероксида водорода, составляло примерно половину общего числа (48,3 ± 1,9 %). Такое соотношение достигалось в поставленной нами модели ОС при инкубации с пероксида водорода в концентрации 40 мкМ в течение 20 минут. При добавлении 1 мМ пептидов (семакса, АКТГ(6-9)PGP) в культуральную среду после воздействия пероксида водорода (40 мкМ) и инкубации в течение ночи семакс снижал долю погибших клеток до 28,4 ± 2,4 %, АКТГ(6-9)PGP –до 35,6 ± 2 %.
Описанные условия моделирования воспаления на клетках микроглии HMC-3 и ОС на нейрональных клетках SH-SY5Y человека были использованы для реализации этапов транскриптомного анализа клеточных РНК. Были получены образцы суммарной РНК из образцов клеток HMC-3 и SH-SY5Y, культивируемых в условиях воспаления и ОС соответственно, а также после обработки пептидами семаксом или АКТГ(6-9)PGP (суммарно 24 образца). Получены библиотеки для высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-Seq) из микроРНК-фракции, полиА-фракции и RNase-R устойчивой фракции РНК клеток. Проведен RNA-Seq анализ фракции микроРНК во всех вышеописанных образцах РНК. Получены архивы первичных прочтений для дальнейшего количественного и функционального биоинформатического анализа.
Таким образом, планы по проекту, намеченные на 2025 год, выполнены полностью. С учетом задела 2025 года, на дальнейших этапах работы по проекту будут получены данные о профиле экспрессии мРНК и некодирующих РНК, а также архитектуре сети циклоРНК-микроРНК-мРНК взаимодействий и будут выяснены метаболические системы клетки, которые могут находиться под контролем данной сети при моделировании ишемии и воздействии пептидов на культурах клеток человека.
Публикации
1.
Мозговой И.В., Царева Е.В., Денисова А.Е., Ставчанский В.В., Губский Л.В., Дергунова Л. В., Лимборская С.А., Филиппенков И.Б.
Differential Expression of Circular RNAs in Rat Brain Regions with Various Degrees of Damage After Ischemia–Reperfusion
International Journal of Molecular Sciences, 26, 21, 10555 (P 1-20) (год публикации - 2025)
10.3390/ijms262110555
2. Шпетко Я.Ю., Мозговой И.В., Дергунова Л.В., Филиппенков И.Б. Дифференциальная экспрессия циклических РНК генов Mvp, Rgs9 и Dlgap4 во фронтальной коре ишемизированных крыс Молекулярная генетика, микробиология и вирусология (год публикации - 2025)
3. Филиппенков И.Б., Сударкина О.Ю., Дергунова Л.В., Мясоедов Н.Ф., Лимборская С.А. Циклические РНК клеток мозга: роль в механизмах ишемического повреждения и нейропротекции Сборник трудов «Молекулярная диагностика 2025», Сборник трудов "Молекулярная диагностика 2025", с. 450-451 (год публикации - 2025)
4. Филиппенков И.Б., Мозговой И.В., Дергунова Л.В. Возможности взаимодействий циклических РНК с нуклеиновыми кислотами и белками Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 43(4 вып. 2):28–32. https://doi.org/10.17116/ molgen20254304228 (год публикации - 2025)