Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект направлен на создание новых высокочувствительных тест-систем для выявления и контроля содержания пестицидов и объединяет разрабатываемые российской стороной подходы к снижению пределов обнаружения тест-систем посредством использования новых функционализированных наноразмерных композитов и их сочетаний с реагентной базой, сформированной китайскими партнерами. Работы первого этапа проекта были сфокусированы на получении новых нанодисперсных маркеров, оценке аффинности иммунореагентов и проверке реализации предлагаемых подходов к высокочувствительному выявлению пестицидов на основании нескольких сочетаний маркеров и иммунореагентов. В качестве маркеров и носителей в разрабатываемых тест-системах рассматривались препараты на основе золотых и ферромагнитных частиц. Отличительной особенностью разработки являлась дополнительная модификация поверхности частиц с целью усиления регистрируемых оптических сигналов. Тем самым становится возможным объединение при проведении тестирования магнитного концентрирование аналитов с высокочувствительным обнаружением меченых иммунных комплексов. При получении золотых частиц использовали восстановление соли золота цитратом при разных соотношениях реагентов, обеспечивая тем самым варьирование диаметра наночастиц. Магнитные частицы синтезировали, проводя соосаждение раствора хлоридов железа (II) и (III), инициируемое гидроксидом аммония. При этом были рассмотрены различные протоколы синтеза, оцениваемые по гомогенности, размерам и стабильности получаемых продуктов. Дальнейшие работы по модификации поверхности магнитных частиц с целью обеспечения стабильности их коллоидных растворов включали их обработку олеиновой кислотой, тетраэтоксисиланом и (3-аминопропил)триэтоксисиланом. Сформированная панель включала препараты диаметром от 100 нм до 2 мкм. Для повышения интенсивности окрашивания меченых комплексов получены также препараты магнитных частиц, модифицируемых тетраэтоксисиланом и (3-аминопропил)триэтоксисиланом в присутствии красителя бромфенолового синего. Показано, что синтезируемые препараты инкапсулируют до 50% введенного красителя с наблюдаемым значительным ростом интенсивности окраски коллоидных растворов, что способствует выявлению меченых иммунных комплексов в меньших концентрациях. Для полученных препаратов модифицированных магнитных частиц проведена оценка их выявления при нанесении на мембранные носители, используемые в иммунохроматографическом анализе, с целью выбора наиболее перспективных препаратов для высокочувствительной иммунохроматографии. Полученные градуировочные зависимости демонстрируют, что синтезированные частицы могут детектироваться в схеме мембранного иммуноанализа до концентраций 300-400 мкг/мл. По данным ультрамикроскопии лазерного рассеяния эти величины соответствуют содержанию частиц порядка 10^(9) на миллилитр, что позволяет проводить эффективную иммунохроматографию. Для создания аналитических систем подготовлена панель иммунореагентов: антител и конъюгатов гаптенов с белками-носителями. Полученные аффинные пары охарактеризованы в схемах равновесного иммуноферментного анализа. Лимитирующим фактором, определяющим пределы обнаружения иммуноаналитических систем, являются константы ассоциации-диссоциации иммунных комплексов. Измеренные равновесные константы диссоциации находились в интервале от 4,3х10^(-11) М для цигалотрина до 2,8х10^(-10) М для ципроконазола, отражая высокую аффинность взаимодействий. Для оценки пределов обнаружения целевых аналитов с учетом установленных характеристик моноклональных антител проводили конкурентное взаимодействие в ИФА. Согласно полученным данным, пределы обнаружения составили: 1,1 нг/мл для имидаклоприда, 160 пкг/мл для фипронила, 10 пкг/мл для 2.4-Д и параквата, 3,3 нг/мл для ципроконазола, 5,1 нг/мл для цигалотрина, 12 нг/мл для хлорпирифоса, 3,8 нг/мл для бифентрина 2,5 нг/мл для диурона и 20 пг/мл для изопротурона. После подтверждения высокой эффективности выявления аналитов в равновесном анализе полученную панель реагентов использовали для разработки неравновесных форматов анализа. Были получены экспрессные иммунохроматографические тест-системы для детекции пестицидов на основе охарактеризованной библиотеки антител. Инструментальные пределы обнаружения пестицидов в иммунохроматографическом анализе (ИХА) составили: 0,002 нг/мл для имидаклоприда, 0,1 нг/мл для 2.4-Д, 0,87 нг/мл для параквата, 0,18 нг/мл для фипронила, 1 нг/мл для диурона и изопротурона, 2,1 нг/мл для бифентрина, 0,96 нг/мл для ципроконазола, 1,9 нг/мл для цигалотрина и 0,67 нг/мл для хлорпирифоса. Проведена оценка возможности мультиплексного ИХА на примере одновременного определения имидаклоприда и параквата. Пределы обнаружения в оптимизированных условиях составили 2,8 нг/мл и 0,67 нг/мл для параквата и имидаклоприда, соответственно. С учетом проведенной оценки эффективности реагентов реализованы и охарактеризованы по эффективности практического применения три экспрессные аналитические системы, в двух из которых для снижения пределов обнаружения реализовывалась иммунохроматография с непрямым мечением специфических антител (использованием сочетания нативных специфических и конъюгированных с наночастицами золота антивидовых антител), а в третьей – гомогенный одностадийный анализ, основанный на регистрации поляризации флуоресценции метки-флуоресцеина в свободном виде и в составе иммунных комплексов. В результате показано селективное выявление имидаклоприда во фруктах и ягодах за 15 мин со снижением предела обнаружения в 20 раз (до 2 пг/мл) по сравнению с традиционным мечением. Степень выявления имидаклоприда – от 75 до 97%. Для иммунохроматографического выявления 2,4-Д в соках посредством непрямого мечения антител достигнуто снижение предела обнаружения до 0,1 нг/мл, степень выявления пестицида – 84-112%. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ в соках и воде (степень выявления – 95-120%) осуществляется за 5 мин с пределом обнаружения 0,4 нг/мл.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Все запланированные по проекту научные результаты достигнуты в полном объеме. Магнитные наночастицы и их композиты синтезировали для использования в качестве маркеров в иммунохроматографических тестах. Препараты наночастиц получали по стандартному протоколу осаждением из хлоридов железа. Было показано, что осаждение гидроксидом натрия приводит к формированию более стабильных и подвижных частиц. Поэтому методика синтеза магнитных частиц была модифицирована по сравнению с предыдущим этапом. Микрофотографии синтезированных МЧ, полученные в ПЭМ, свидетельствуют об образовании агрегатов, что характерно для немодифицированных МЧ. Средний диаметр агрегатов МЧ составил 100 ± 12 нм. Значения гидродинамического диаметра, определенные методом динамического светорассеяния (ДРС), составили 920 ± 68 нм. Агрегационная устойчивость частиц магнетита была оценена с использованием дзета-потенциала, который составил -7,9 ± 0,5 мВ. Спектральная характеристика препаратов показала, что максимум поглощения нативных МНЧ и МНЧ с инкапсулированными красителями, локализован в области 550 нм; для НЧЗ – 525 нм; для ЗНЦ – 650 нм; для КвТ разного размера пики флуоресценции были при 585 и 625 нм соответственно. Агрегация магнетита приводит к усилению магнитных свойств, поэтому следует соблюдать баланс между стабильностью и агрегацией. Разработанный протокол синтеза магнитных наночастиц позволяет получать более диффузионно подвижные частицы при сохранении магнитных свойств. Основными работами второго этапа были оптимизации иммунохроматографических тест-систем, обеспечивающих получение достоверных результатов и достижения минимальных пределов обнаружения. В результате оценки влияния среднего времени миграции жидкости на интенсивность регистрируемого сигнала в аналитической зоне для дальнейшей работы выбрали мембрану компании Millipore марки HF090. Варьировали концентрации конъюгата МЧ со специфическими антителами к параквату. Была выбрана концентрация конъюгата МЧ 31,25 мкг/мл. Установлена зависимость предела обнаружения от концентрации конъюгата паракват-БСА, иммобилизованного в аналитической зоне рабочей мембраны. При проведении анализа с более низкими концентрациями конъюгата гаптен-белок визуальный предел обнаружения составил 1,2 нг/мл для обоих случаев, а инструментальные пределы обнаружения составили 0,02 нг/мл и 0,2 нг/мл для конъюгата паракват-БСА с концентрацией 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл. При разработке тест-системы для определения ципроконазола было использовано два конъюгата – МЧ-специфические антитела к ципроконазолу и ЗНЦ-антивидовые антитела. С увеличением концентрации конъюгата на основе МЧ, а также при повышении оптической плотности конъюгата на основе ЗНЦ интенсивность сигнала в аналитической зоне растет. Выбрали конъюгат ЗНЦ-антивидовые антитела с оптической плотностью, равной 0,5. Для конъюгата МЧ-специфические антитела выбрана концентрация 250 мкг/мл. Для конъюгата ципроконазол-БСА, иммобилизованного в аналитической зоне, выбрали концентрацию 0,5 мг/мл, что обеспечивало более низкие значения визуального и инструментального пределов обнаружения. Для ИХА 2,4-Д определены используемые концентрации специфических антител, конъюгата 2,4-Д-тиреоглобулин (2,4-Д-ТГ), а также установлены последовательность и длительности стадий анализа. Концентрация антител 2 мкг/мл была выбрана для обеспечения минимального предела обнаружения и достаточной окраски для надежного и точного тестирования. Снижение концентрации конъюгата 2,4-Д-ТГ в аналитической зоне с 1 до 0,5 мг/мл позволило снизить инструментальный предел обнаружения с 0,5 до 0,1 нг/мл. ИХА, основанный на сочетании МЧ и НЧЗ, использовали для определения параквата в образцах мякоти апельсина. Предел визуального обнаружения составил 1,2 нг/мл, а предел инструментального обнаружения – 0,12 нг/мл (0,24 мкг/кг), что соответствует установленному максимально допустимому уровню содержания параквата в апельсинах (0,02 мг/кг). Степень выявления параквата составила от 96 до 110 %. Кроме того, для снижения предела обнаружения анализа применялось магнитное концентрирование антигена с использованием конъюгата МЧ-специфические антитела. Достигнутые пределы обнаружения ципроконазола (комбинация МЧ и ЗНЧ) составили 3,7 нг/мл (визуальный) и 0,4 нг/мл (инструментальный). В ходе реализации ИХА с непрямым введением маркера проводили определение 2,4-Д в образцах сока, полученных из апельсина, винограда и кабачка путем прямого отжима. Степень выявления аналитов разработанными тест системами составила 96-120% для параквата, 82-110% для ципроконазола и 84-112% для 2,4-Д, что позволяет получать достоверные результаты при работе с реальными пищевыми матрицами. Воспроизводимость (погрешность) определения аналитов в области IC50 - не более 16, 17 и 7% для параквата, ципроконазола и 2,4-Д соответственно. Внутрисерийная погрешность на 20-30% меньше междусерийной. Полученные результаты были использованы для реализации мультипараметрического ИХА для одновременного определения ципроконазола и фипронила. Достигнутые пределы визуальной и инструментальной детекции составили 3,7 нг/мл и 0,5 нг/мл для фипронила, соответственно, а для ципроконазола – 11 нг/мл и 0,3 нг/мл. Мякоть и соки из овощей и фруктов имеют сложный многокомпонентный состав , который оказывает влияние на результаты ИХА и чувствительности анализа. Оптимизация пробоподготовки образцов соков показала, что при разбавлении в 10 раз конкурентная кривая практически совпадает с калибровочной кривой в ФБСТ. Для определения аналитических характеристик тест-систем были использованы образцы с минимально возможным разбавлением, то есть в 2 раза. В образцы сока вносили разные концентрации 2,4-D и проводили анализ. Степень выявления аналитов в разработанном мульти-ИХА позволяют определять 93-115% фипронила и 83-110% ципроконазола. Селективность разработанных тест-систем была проверена с использованием пестицидов других групп (пропазин, бифентрин, диурон, и лямбда-цигалотрин) на примере разработанного ИХА для определения параквата. Реакция параквата со специфическими антителами исключает возможность связывания метки с конъюгатом параквата с БСА в аналитической зоне тест-полоски. Поэтому окрашивания аналитической зоны не наблюдалось. Тестируемые пестициды не связываются с антителами к параквату. По материалам проведенных исследований в 2025 г. опубликованы две статьи в журналах уровня Q1 - "Biosensors" и "Journal of Food Composition and Analysis", две подготовленные статьи находятся на рассмотрении.