Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект направлен на создание новых высокочувствительных тест-систем для выявления и контроля содержания пестицидов и объединяет разрабатываемые российской стороной подходы к снижению пределов обнаружения тест-систем посредством использования новых функционализированных наноразмерных композитов и их сочетаний с реагентной базой, сформированной китайскими партнерами. Работы первого этапа проекта были сфокусированы на получении новых нанодисперсных маркеров, оценке аффинности иммунореагентов и проверке реализации предлагаемых подходов к высокочувствительному выявлению пестицидов на основании нескольких сочетаний маркеров и иммунореагентов. В качестве маркеров и носителей в разрабатываемых тест-системах рассматривались препараты на основе золотых и ферромагнитных частиц. Отличительной особенностью разработки являлась дополнительная модификация поверхности частиц с целью усиления регистрируемых оптических сигналов. Тем самым становится возможным объединение при проведении тестирования магнитного концентрирование аналитов с высокочувствительным обнаружением меченых иммунных комплексов. При получении золотых частиц использовали восстановление соли золота цитратом при разных соотношениях реагентов, обеспечивая тем самым варьирование диаметра наночастиц. Магнитные частицы синтезировали, проводя соосаждение раствора хлоридов железа (II) и (III), инициируемое гидроксидом аммония. При этом были рассмотрены различные протоколы синтеза, оцениваемые по гомогенности, размерам и стабильности получаемых продуктов. Дальнейшие работы по модификации поверхности магнитных частиц с целью обеспечения стабильности их коллоидных растворов включали их обработку олеиновой кислотой, тетраэтоксисиланом и (3-аминопропил)триэтоксисиланом. Сформированная панель включала препараты диаметром от 100 нм до 2 мкм. Для повышения интенсивности окрашивания меченых комплексов получены также препараты магнитных частиц, модифицируемых тетраэтоксисиланом и (3-аминопропил)триэтоксисиланом в присутствии красителя бромфенолового синего. Показано, что синтезируемые препараты инкапсулируют до 50% введенного красителя с наблюдаемым значительным ростом интенсивности окраски коллоидных растворов, что способствует выявлению меченых иммунных комплексов в меньших концентрациях. Для полученных препаратов модифицированных магнитных частиц проведена оценка их выявления при нанесении на мембранные носители, используемые в иммунохроматографическом анализе, с целью выбора наиболее перспективных препаратов для высокочувствительной иммунохроматографии. Полученные градуировочные зависимости демонстрируют, что синтезированные частицы могут детектироваться в схеме мембранного иммуноанализа до концентраций 300-400 мкг/мл. По данным ультрамикроскопии лазерного рассеяния эти величины соответствуют содержанию частиц порядка 10^(9) на миллилитр, что позволяет проводить эффективную иммунохроматографию. Для создания аналитических систем подготовлена панель иммунореагентов: антител и конъюгатов гаптенов с белками-носителями. Полученные аффинные пары охарактеризованы в схемах равновесного иммуноферментного анализа. Лимитирующим фактором, определяющим пределы обнаружения иммуноаналитических систем, являются константы ассоциации-диссоциации иммунных комплексов. Измеренные равновесные константы диссоциации находились в интервале от 4,3х10^(-11) М для цигалотрина до 2,8х10^(-10) М для ципроконазола, отражая высокую аффинность взаимодействий. Для оценки пределов обнаружения целевых аналитов с учетом установленных характеристик моноклональных антител проводили конкурентное взаимодействие в ИФА. Согласно полученным данным, пределы обнаружения составили: 1,1 нг/мл для имидаклоприда, 160 пкг/мл для фипронила, 10 пкг/мл для 2.4-Д и параквата, 3,3 нг/мл для ципроконазола, 5,1 нг/мл для цигалотрина, 12 нг/мл для хлорпирифоса, 3,8 нг/мл для бифентрина 2,5 нг/мл для диурона и 20 пг/мл для изопротурона. После подтверждения высокой эффективности выявления аналитов в равновесном анализе полученную панель реагентов использовали для разработки неравновесных форматов анализа. Были получены экспрессные иммунохроматографические тест-системы для детекции пестицидов на основе охарактеризованной библиотеки антител. Инструментальные пределы обнаружения пестицидов в иммунохроматографическом анализе (ИХА) составили: 0,002 нг/мл для имидаклоприда, 0,1 нг/мл для 2.4-Д, 0,87 нг/мл для параквата, 0,18 нг/мл для фипронила, 1 нг/мл для диурона и изопротурона, 2,1 нг/мл для бифентрина, 0,96 нг/мл для ципроконазола, 1,9 нг/мл для цигалотрина и 0,67 нг/мл для хлорпирифоса. Проведена оценка возможности мультиплексного ИХА на примере одновременного определения имидаклоприда и параквата. Пределы обнаружения в оптимизированных условиях составили 2,8 нг/мл и 0,67 нг/мл для параквата и имидаклоприда, соответственно. С учетом проведенной оценки эффективности реагентов реализованы и охарактеризованы по эффективности практического применения три экспрессные аналитические системы, в двух из которых для снижения пределов обнаружения реализовывалась иммунохроматография с непрямым мечением специфических антител (использованием сочетания нативных специфических и конъюгированных с наночастицами золота антивидовых антител), а в третьей – гомогенный одностадийный анализ, основанный на регистрации поляризации флуоресценции метки-флуоресцеина в свободном виде и в составе иммунных комплексов. В результате показано селективное выявление имидаклоприда во фруктах и ягодах за 15 мин со снижением предела обнаружения в 20 раз (до 2 пг/мл) по сравнению с традиционным мечением. Степень выявления имидаклоприда – от 75 до 97%. Для иммунохроматографического выявления 2,4-Д в соках посредством непрямого мечения антител достигнуто снижение предела обнаружения до 0,1 нг/мл, степень выявления пестицида – 84-112%. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ в соках и воде (степень выявления – 95-120%) осуществляется за 5 мин с пределом обнаружения 0,4 нг/мл.