Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Хмель (Humulus lupulus L.) - многолетнее двудомное растение семейства Cannabaceae. Несмотря на широкое использование и большую важность, этот вид крайне мало исследован на генетическом уровне, и большая часть его разнообразия, доступного селекционерам, мало изучена. Российская коллекции хмеля обыкновенного Чувашского НИИСХ является уникальной по количеству собранных в ней сортов, имеющих различное географическое происхождение, характеризующихся различными уровнями содержания вторичных метаболитов, группами спелости, устойчивостью к патогенам. Коллекция содержит большое количество диких образцов, относящихся к различным областям России и местных сортов из России и Европы. Понимание генетического разнообразия, заключенного в данной коллекции, является значительным шагом к его практическому использованию для повышения эффективности селекционного процесса хмеля в России. В рамках данного проекта были проведены работы, нацеленные на генотипирование коллекции хмеля обыкновенного по множественным однонуклеотидным полиморфизмам, для получения необходимого материала для оценки генетического разнообразия и изучения генетического контроля важных хозяйственных признаков и на исследование генетического разнообразия, содержащегося в коллекции Чувашского НИИСХ и описание ее популяционно-генетической структуры. В частности, на первом этапе была проведена работа по подбору оптимального протокола для проведения масштабного генотипирования образцов коллекции хмеля с помощью GBS (genotyping-by-sequencing). GBS является на сегодняшний день "золотым стандартом", используемым для выявления множественных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в больших популяциях растений. Для достижения максимальной эффективности генотипирования, а именно получения большого количества достоверных SNP необходимо адаптировать данный метод для генома исследуемого растения, в частности, подобрать правильные рестрикционные эндонуклеазы. На основании результатов проведенной in silico и in vitro полногеномной рестрикции генома хмеля с использованием 50 рестриктаз и их сочетаний и последующего секвенирования тестовой библиотеки, полученной с помощью выбранного фермента, и сравнения полученных результатов с ранее полученными в нашей лаборатории данными было предложено использование HindIII/NlaIII протокола для GBS хмеля. Данный протокол позволяет получить % покрытия генома на уровне 1.5% при желаемой глубине покрытия 20x и до сотни тысяч однонуклеотидных полиморфизмов, из которых до 40% могут локализоваться в кодирующих участках генома. На основе проведенной работы был предложен алгоритм подбора GBS-протокола для получения оптимального количества и качества однонуклеотидных полиморфизмов для различных последующих исследований. Причем, на основании наших результатов, можно предложить использование GBS-протоколов с разными рестрикционными эндонуклеазами что для одного и того же вида растения для получения максимальной эффективности генотипирования в зависимости от целей исследования. Выбранный протокол был использован для получения геномных GBS библиотек для 323 образцов генетической коллекции хмеля Чувашского НИИСХ. Последующий биоинформатический "процессинг" полученных "сырых данных" с использованием оптимизированного алгоритма показал, что для исследуемых образцов было получено в среднем 18 754 453 ± 7 621 768,073 прочтений, глубина прочтения для большинства образцов составила более 30x. В результате обработки полученных прочтений нами было получена информация о 1 769 852 полиморфизмах, содержащихся в исследованной выборке образцов хмеля (всего 206 образцов). После проведения фильтрации однонуклеотидных полиморфизмов было получено 302 792 SNPs, пригодных для дальнейшего использования для проведения популяционных, филогенетических и ассоциативных исследований. Проведенный анализ полученных однонулеотидных полиморфизмов показал их относительно равномерное распределение по 10 хромосомам хмеля (2n = 18 + X/Y) с преобладанием SNP, расположенных в некодирующих участках. Чуть более 10% всех аннотированных генов в геноме хмеля содержат идентифицированые полиморфизмы. Была проведена оценка основных параметров генетического разнообразия коллекции на основе 302 792 SNP, включая индекс PIC и частоты минорного аллеля, и показано, что на уровне исследованных в настоящей работе образцов хмеля можно говорить о сохранении относительно высокого уровня генетического разнообразия (индекс PIC в пределах 0.25-0.5). Данные по SNP генотипам в исследуемой коллекции были использованы для оценки уровня неравновесия по сцеплению (LD) в геноме хмеля. Было показано, что снижение уровня LD в геноме хмеля происходит очень медленно и пороговый уровень LD (r2) = 0.2 достигается только для SNP, расположенных на физическом расстоянии 22.4 Мб в геноме. На основании этого идентифицированные SNP были распределения по бинам с высоким уровнем LD, для дальнейшей работы было отобрано 11 791 однонуклеотидных полиморфизмов. На следующем этапе реализации проекта с помощью методов DAPC и Admixture была исследована популяционного-генетическая (популяционно-геномная) структура исследуемой коллекции основе минимального набора из 11 791 SNP. На первом этапе был проведен поиск оптимального числа субпопуляций (групп) с помощью k-means и Admixture. С помощью обоих методов было выделено 10 подгрупп в исследуемой выборке. Анализ главных компонент с наложением данных по субпопуляциям показал низкий уровень генетической дифференциации и слабое фактическое разделение сортообразцов между группами. На графике PCA можно выделить лишь 4 отчетливые группы образцов, которые большей частью включают в себя дикие образцы и местные сорта Европейской части России. Были получены дендрограммы, демонстрирующие реконструкцию филогенетических отношений между 206 сортообразцами, дикими образцами и ландрасами в исследуемой коллекции. Показано, что кластеризация образцов во многом соответствует результатам популяционно-генетического анализа. Интересным оказалась кластеризация некоторых сортов хмеля вместе с дикими образцами из России и ландрасами. На заключительном этапе реализации проекта были проведены ассоциативные исследования с привлечением полученных данных по популяционной структуре и фенотипических данных для поиска оптимальной модели и получения наиболее достоверных данных по ассоциированным SNP. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта были представлены на двух международных конференциях: International Conference on Plant Biology and Biotechnology (ICPBB 2024), Казахстан, Алматы, 3-6 июня 2024 (https://primerdigital.com/ICPBB2024/files/ABSTRACTS_BOOK.pdf) и Международной научно-практической конференции "Геномика и современные биотехнологии в размножении, селекции и сохранении растений" GenBio24, ВНИИСХБ, Москва, 7-11 октября 2024 г (https://conf-genbio.ru/#program-section).