Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проведен анализ фенотипической чувствительности к цефтриаксону и азитромицину 124 клинических изолятов N. gonorrhoeae, полученных в 2024 г., включая 91 образец из Москвы, 18 образцов из Калуги, 5 – Новосибирска, 4 – Астрахани, 4 – Чебоксар, 2 – Казани. Методом серийных разведений на агаре установлены минимальные подавляющие концентрации (МПК) цефтриаксона и азитромицина, изоляты классифицированы на чувствительные и устойчивые в соответствии с критериями МУК и EUCAST. Все изоляты были чувствительны к цефтриаксону, что подтверждает выбор цефалоспоринов III поколения для терапии гонококковой инфекции в России. Выявлено 11% устойчивых к азитромицину изолятов, что выше рекомендуемого для применения антибиотика в схемах терапии порога ВОЗ в 5%. Полученные данные ставят под сомнение перспективы комбинированной «цефтриаксон + азитромицин» терапии гонореи в России. В целом, распространение в России вариантов N. gonorrhoeae, устойчивых к актуальным противомикробным препаратам, пока несопоставимо с ситуацией в странах Европы, Азии и Америки, где систематически обнаруживаются штаммы с множественной лекарственной устойчивостью, в особенности к рекомендованным препараторам. Для всех 124 изолятов из сформированной выборки проведено таргетное секвенирование аллелей генов «домашнего хозяйства» abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC, pgm, используемых для MLST-типирования. Получены нуклеотидные последовательности аллелей, им присвоены соответствующие номера по номенклатуре pubMLST (https://pubmlst.org). Распределение аллелей в сформированной выборке было следующим: ген abcZ (аллели 59, 109, 126); ген adk (аллели 39, 937); ген aroE (аллели 170, 67, 764, 810, 956); ген fumC (аллели 78, 158, 156, 111, 238, 237, 818, 1189); ген gdh (аллели 148, 152, 149, 188, 146, 147, 734, 229); ген pdhC (аллели 154, 71, 153), ген pgm (аллели 63, 33). У ряда изолятов Московского региона, полученных по большей части от мигрантов из стран ближнего зарубежья, обнаружены уникальные аллели данных генов, не зарегистрированные среди изолятов из других регионов России. Таким образом, Москва может выступать источником новых эпидемиологически значимых клональных линий гонококка на территории России, в том числе вследствие трансграничного переноса изолятов из других стран. Среди проанализированных аллелей выявлены сцепленные полиморфизмы, связанные с устойчивостью к цефтриаксону (гены penA, ponA, porB) и азитромицину (гены mtrR, mtrD, 23S рРНК). Обнаружены детерминанты устойчивости в мозаичных вариантах генов penA, mtrR и mtrD, возникших в результате межвидовой рекомбинации N. gonorrhoeae и близкородственных Neisseria spp. Так, между мозаичной аллелью penA 34, ассоциированной со сниженной чувствительностью к цефтриаксону, и генами «домашнего хозяйства» выявлено 13 сцепленных полиморфизмов. Относительно мозаичных вариантов mtrR и mtrD, ассоциированных с устойчивостью к азитромицину, анализ показал наличие 16 сцепленных полиморфизмов с генами «домашнего хозяйства». Поиск сцепленных полиморфизмов в 23S рРНК оказался нецелесообразным из-за низкой распространенности таких мутаций (менее 1% изолятов). Такие изоляты встречаются редко в российской популяции и не связаны с определёнными аллелями генов «домашнего хозяйства». Анализ вариантов porB показал отсутствие сцепленных полиморфизмов, что объясняется высокой вариабельностью porB по сравнению с консервативными генами «домашнего хозяйства». С использованием аллелей генов «домашнего хозяйства», выявленных в России в 2024 году, и аллелей из базы PubMLST, сформирована выборка из последовательностей геномов 21402 изолятов, включая 124 российских. Исследуемая выборка характеризовалась 1442 уникальными MLST-генотипами. Создано множественное выравнивание размерностью 1442 генотипа и длиной 3288 п.о., состоящее из уникальных конткатенированных последовательностей генов abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC, pgm. Для всех 3288 положений во множественном выравнивании получены значения плотности нуклеотидных замен и выбраны 18 положений с плотностью более 5%: - положения 34, 205 гена abcZ; - положения 565, 611 гена adk; - положения 1112, 1271 гена aroE; - положения 1526, 1646, 1649, 1685, 1691 гена fumC; - положения 1886, 1937, 2028, 2282 гена gdh; - положения 2513, 2775 гена pdhC; - положение 3276 гена pgm. Для каждого из 1442 молекулярных типов получена нуклеотидная последовательность (нуклеотидный профиль miniMLST), состоящий из информативных нуклеотидов, которые расположены в выбранных 18 положениях, и позволяют различать существующие MLST генотипы. С целью анализа информативных полиморфизмов в выбранных 18 положениях в геноме N. gonorrhoeae сконструированы праймеры для мультиплексной ПЦР и олигонуклеотидных зонды для иммобилизации на биочипе, позволяющем идентифицировать соответствующие информативные полиморфизмы. Проведён синтез и контроль качества праймеров и зондов. Разработана и оптимизирована процедура мультиплексной амплификации локусов abcZ, adk, aroE, fumC, gdh, pdhC и pgm, позволяющая получать флуоресцентно-меченые фрагменты для последующей гибридизации на олигонуклеотидном биочипе. Разработанная процедура включает два этапа мультиплексной ПЦР в отдельных пробирках: на первом этапе в избытке нарабатываются геномные фрагменты, ограниченные соответствующими праймерами, а на втором – их одноцепочечные флуоресцентно-меченые копии. Полученная после второго этапа амплификации смесь ПЦР-продуктов будет применяться для последующей гибридизации на биочипах. Таким образом, создан метод определения 18 информативных нуклеотидов и, соответственно, определения MLST-генотипа N. gonorrhoeae, на основе мультиплексной ПЦР с последующей гибридизацией на оригинальном олигонуклеотидном биочипе.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
За 2025 год сформирована коллекция образцов ДНК клинических изолятов N. gonorrhoeae, включающая различные регионы России, в том числе Московский регион. Всего собрано и охарактеризовано 92 изолята. Для каждого изолята проведено определение минимальной подавляющей концентрации к цефтриаксону и азитромицину методом серийных разведений на агаре. Все 92 изолята продемонстрировали фенотипическую чувствительность к цефтриаксону, что подтверждает целесообразность его применения в качестве препарата первой линии. В отношении азитромицина выявлено 4,3% устойчивых изолятов, включая штамм с высоким уровнем резистентности (МПК=4 мг/л), что подчеркивает необходимость постоянного эпидемиологического мониторинга. Завершена разработка нового метода MLST-генотипирования N. gonorrhoeae на основе отечественной технологии олигонуклеотидных гидрогелевых биочипов. Метод основан на анализе 18 информативных однонуклеотидных полиморфизмов в семи высококонсервативных генах «домашнего хозяйства». Разработана и оптимизирована двухэтапная процедура мультиплексной ПЦР с флуоресцентным мечением и последующей гибридизацией на разработанном биочипе, содержащем 36 олигонуклеотидных зондов. Создана программа для автоматической интерпретации сигналов чипа и определения MLST-генотипа изолята. По результатам апробации на всей коллекции из 266 изолятов (2024-2025 гг.) метод показал высокие диагностические характеристики: чувствительность (100%), специфичность (86,1%) и точность, сопоставимую с референсным MLST-генотипированием (97,7%). Проведен сравнительный анализ MLST-генотипов, циркулировавших в Москве и других регионах России в 2024-2025 годах. Популяция возбудителя характеризовалась значительным генетическим сходством, обладая общими доминирующими генотипами – ST-10314 и ST-8143. При этом в Москве наблюдалось большее разнообразие второстепенных генотипов, а в регионах выявлялись генотипы, не характерные для столицы, в частности ST-11706. Анализ ассоциаций генотипов и фенотипической чувствительности показал связь генотипа ST-9363 с устойчивостью к азитромицину и ST-1901 со сниженной чувствительностью к цефтриаксону. Особую эпидемиологическую опасность представляют изоляты, сочетающие сниженную чувствительность к цефтриаксону с резистентностью к азитромицину, выявленные в нескольких регионах. В результате филогенетического анализа установлены происхождение и генетические связи ключевых линий N. gonorrhoeae в России. Выявлен высокий уровень сцепления (76,3%) между генотипами по схемам MLST и NG-MAST, подтверждающий существование устойчивых генетических кластеров в российской популяции. Показано, что основу популяции составляет автохтонный чувствительный кластер MLST-1594/NG-MAST-807. Также установлено, что линии MLST-9363/NG-MAST-12302 и MLST-1901/NG-MAST-1407, ассоциированные с устойчивостью к азитромицину и сниженной чувствительностью к цефтриаксону соответственно, по-видимому, были занесены в страну в результате трансграничного переноса из Европы. Проведена комплексная оценка перспектив применения актуальных антимикробных препаратов в России. Разработанный метод MLST-генотипирования на биочипе показал высокие диагностические характеристики, что делает его пригодным для массового эпидемиологического скрининга. Анализ сформированной коллекции изолятов за весь период выполнения проекта подтвердил целесообразность использования цефтриаксона в качестве препарата первой линии на территории России, в соответствии с текущими клиническими рекомендациями Минздрава (Министерство здравоохранения, клинические рекомендации «Гонококковая инфекция», 2024). Вместе с тем циркуляция занесенных в Россию европейских устойчивых линий и локальные очаги резистентности к азитромицину делают невозможным применение комбинированной терапии цефтриаксон + азитромицин и диктуют необходимость продолжения молекулярно-эпидемиологического надзора с использованием разработанного метода молекулярно-генетического типирования возбудителя гонококковой инфекции.