Аннотация результатов, полученных в 2024 году
I. Одной из целей данной работы было получение красных/дальнекрасных флуоресцентных белков (ФБ) с пониженной иммуногенностью для дальнейшего получения экспрессирующих его опухолевых клеточных линий для использования в опухолевых моделях на мышах BALB/c. В качестве первого объекта для мутаций был выбран TagRFP – красный ФБ с высоким коэффициентом экстинкции и длительным временем жизни флуоресценции, показавший себя надежным внутриклеточным генетически кодируемым маркером и не склонный к существенной агрегации в условиях, моделирующих живую клетку. Была проведена оценка аминокислотной последовательности белка TagRFP для определения в нем потенциальных иммунодоминатных эпитопов MHC-I при помощи интернет-ресурса NetMHC-4.0. Из найденных 18 пептидов-потенциальных эпитопов для MHC-I были выбраны два, VAVARYCDL и RYDCLPSKL, расположенные на C-конце ФБ за пределами бета-бочонка либо частично на конце последнего бета-тяжа, чтобы минимизировать влияние замены аминокислотного остатка на фолдинг белка и созревание флуорофора. Для них было проведено аланиновое сканирование in silico с оценкой изменения аффинности по сравнению с исходными из последовательности исходного белка TagRFP (“TagRFP дикого типа”, TagRFP-WT); по результатам сканирования были выбраны положения для замены аминокислотных остатков на аланин (225 и 228 а.о.), при которых существенно снижалась аффинность хотя бы одного из эпитопов. Был проведен сайт-направленный мутагенез в этих положениях. Полученные гены исходного белка TagRFP-WT и белков с соответствующими заменами (Y225A и L228A) клонированы в вектор pET22b (NdeI/EcoRI) для экспрессии белков в E.Coli. Далее E.Coli BL21 (DE3) были трансформированы полученными плазмидами, наработана клеточная масса, белки выделены и очищены при помощи разработанной двустадийной методики, включающей последовательную гидрофобную (HiPrep Phenyl FF) и катионообменную (MonoS) хроматографию. Были получены достаточно чистые фракции целевых белков, что подтверждено гель-электрофорезом. Методами спектроскопии, гель-фильтрации и динамического светорассеяния было показано, что мутации Y225A и L228A в TagRFP не привели к существенному изменению физико-химических свойств белка. Были экспериментально подобраны оптимальные условия иммунизации ФБ мышей BALB/c, а также анализа мышиных сывороток путем ИФА на адсорбированном в лунках микропланшета TagRFP-WT. На основании результатов предварительного эксперимента иммунизация проводилась белками в физрастворе, смешанном с адъювантами Фрейнда в соотношении 1:1. Мышей иммунизировали как нативными белками TagRFP-WT, TagRFP Y225A, TagRFP L228A, так и денатурированными в течение 5 минут при 95°С. Во втором случае мышиные сыворотки проверяли на связывание с денатурированным белком TagRFP-WT. При иммунизации нативными белками связывание мышиных сывороток с адсорбированным нативным белком TagRFP-WT не уменьшается в случае мутанта TagRFP Y225A и уменьшается примерно в 5 раз в случае мутанта TagRFP L228A. При иммунизации же денатурированными белками связывание мышиных сывороток с адсорбированным денатурированным белком TagRFP-WT уменьшается как для белка TagRFP L228A – примерно в 2 раза, так и для белка TagRFP L225A – примерно в 9 раз. По-видимому, подобные различия связаны с тем, что 225 аминокислотный остаток расположен сразу после бета-бочонка и в нативном виде изменения в содержащих его эпитопах «экранированы» от распознавания иммунной системой. Оба полученных мутанта, TagRFP L228A и TagRFP L225A, на данный момент представляются перспективными для создания флуоресцирующих опухолевых клеточных линий и опухолевых моделей для мышей BALB/c. Результаты этой работы вошли в статью, которая принята в печать в журнале “Молекулярная генетика, микробиология и вирусология” и будет опубликована в 2025 году. II. Вторая часть работы по гранту включала в себя получение плазмид для экспрессии, в том числе под контролем HSP70-промотора, красных флуоресцентных белков, включая мутантные форм с пониженной иммуногенностью, в эукариотических клетках. Для проверки экспрессии флуоресцентных белков под воздействием HSP-промотора были подобраны первоначальные условия для моделирования теплового шока при условии сублетального воздействия на клетки, чтобы иметь возможность наблюдать экспрессию ФБ в живых клетках под контролем HSP70-промотора. Для этого использовалось нагревание монослоев клеток мышиного рака молочной железы 4T1 использовалось до повышенных температур (41-42 °C) с последующим восстановлением при 37°C. Исходя из данных по изменениею морфологии клеток в разные моменты времени после воздействия, а также выживаемости клеток, предполагается в дальнейшем использовать режим, предполагающий 5-10 минут нагревания монослоя клеток до 42°С. Получена эукариотическая плазмида, в которой экспрессия флуоресцентных белков должна происходить под контролем HSP70-промотора. В качестве вектора была выбрана плазмида pcDNA3. HSP70-промотор получен методом ПЦР из плазмиды HSP70-mPlum (Addgene, США). В качестве сайтов клонирования выбраны NdeI/HindIII для полного удаления Т7 промотора и частичного-CMV промотора. После рестрикции по NdeI остается порядка 300 пар оснований CMV энхансера. Затем для TagRFP WT, L228A и Y225A получены ПЦР-фрагменты и клонированы в вектор pcDNA3-HSP70 по сайтам HindIII/XhoI; cтруктуры полученных плазмид подтверждены секвенированием. Были также получены стандартные эукариотические плазмиды, кодирующие экспрессию TagRFP-WT, TagRFP Y225A и TagRFP L228A, на базе вектора pcDNA3. Была проведена липосомальная трансфекция полученными конструкциями для TagRFP-WT, TagRFP Y225A и TagRFP L228A опухолевых клеток млекопитающих (мышиного рака молочной железы 4T1 и человеческого рака легкого A549) с использованием реагента GenJect39, оптимизированы условия трансфекции для клеток 4T1. Не было отмечено дополнительной токсичности для опухолевых клеток, связанной с внесенными в белок TagRFP мутациями. Однако доля клеток, экспрессирующих TagRFP и мутанты как после трансфекции как с использованием pcDNA3, так и pcDNA3-HSP70, существенно не отличалась, хотя визуально в среднем в случае pcDNA3-HSP70 интенсивность флуоресценции клеток была в 1,5-2 раза ниже, чем для pcDNA3. Но для клеток с pcDNA3-HSP70 экспрессия должна была индуцироваться тепловым шоком, которого в данном случае не было. Поэтому для дальнейших исследований полученная конструкция должна быть оптимизирована. По-видимому, оставшейся последовательности CMV-энхансера оказалось достаточно для поддержания конститутивной экспрессии гена TagRFP-WT и мутантных форм. Было решено удалить остатки CMV энхансера и клонировать HSP-промотор с TagRFP по сайтам MluI/XhoI при помощи эндонуклеазы MluI. Были получены стабильно флуоресцирующие клоны отселектированных клеток 4T1-TagRFP-WT, 4T1-TagRFP-228A, 4T1-TagRFP-225A для создания опухолевых моделей с последующей оценкой гуморального иммунного ответа.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Была оптимизирована векторная плазмида для эукариотических клеток, кодирующая экспрессию ФБ, включая варианты белка с пониженной иммуногенностью, под контролем HSP-промотора. Было показано, что в результате фоновая флуоресценция трансфицированных такими плазмидами клеток вне моделирования условий теплового шока практически не наблюдается. Были созданы клоны опухолевых клеток на основе мышиной опухоли молочной железы 4T1, экспрессирующие белки TagRFP WT, TagRFP Y225A, TagRFP L228A с вышеуказанной плазмидой, которые должны экспрессировать красные флуоресцентные в условиях теплового шока. Было показано, что некоторые клоны клеток 4T1 TagRFP WT-Н и TagRFP L228A-H эффективно экспрессируют соответствующие белки в условиях теплового шока. Были получены опухолевые модели на основе исходных клеток 4T1, а также на основе полученных в прошлом году клеточных линий клеток с конститутивной экспрессией флуоресцентных белков 4T1 TagRFP WT, 4T1 TagRFP Y225A и 4T1 TagRFP L228A и на мышах линии BALB/c. Для этих моделей показано отсутствие существенного влияния экспрессии флуоресцентных белков на скорость роста опухолей. Также показано путем ИФА, что гуморальный иммунный ответ на экспрессию флуоресцентного белка у мышей с опухолями 4T1 TagRFP Y225A и 4T1 TagRFP L228A в 4-5 раз слабее гуморального иммунного ответа у мышей с опухолями 4T1 TagRFP WT/ Были получены путем сайт-насыщающего мутагенеза мутантные формы белка TagRFP с заменами в положении Gly171, находящемся на гибкой петле между слоями бета-бочонка флуоресцентного белка. Из полученных 16 колоний были выбраны лучшие три по флуоресценции, путем секвенирования соответствующих участков (вставок) ДНК показано, что произведены замены G171D, G171K и G171T. Данные белки были наработаны, выделены и очищены. Показано, что их квантовый выход флуоресценции незначительно уменьшился по сравнению с квантовым выходом флуоресценции исходного белка. По результатам гель-фильтрации было показано, что в мутанты TagRFP G171T, TagRFP G171D и TagRFP G171K находятся в растворе в мономерной форме, их молекулярная масса находится в пределах 24-30 кДа. Был оценен гуморальный иммунный ответ на эти белки в сравнении с исходным TagRFP после иммунизации мышей BALB/c смесями очищенных белков с адьювантами Фрейнда. Результаты показывают, что замена глицина 171 на аспарагин наиболее эффективно снизила связывание мышиных сывороток с исходным белком, в то время как эффективность его замены на лизин повлияла не существенно, а замена на треонин в целом, возможно, даже увеличила это связывание. Были получены и охарактеризованы опухолевые модели для иммунокомпетентных мышей, экспрессирующие полученные варианты TagRFP, в том числе под контролем HSP-промотора (для линий 4T1 TagRFP WT и 4T1 TagRFP L228A). Для моделирования условий теплового шока с целью оценки in vivo экспрессии флуоресцентных белков под контролем HSP-промотора была выбрана внутриопухолевая сенсибилизация опухолей дальне-красным красителем ICG (индоцианиновый зеленый), который при облучении светом с длиной волны около 800 нм, в зависимости от условий, вызывает фототермическое либо фототоксическое действие. Было показано, что некоторые участки опухолей через сутки после облучения опухолей, сенсибилизированных внутриопухолево ICG (100 мкл, доза 4 мг/кг веса животного), лазерным излучением (798 нм, 800 мВт/см2) в течение 2 минут, продемонстрировали флуоресцентный сигнал, однако другие части опухолей остались затемненными. Было показано, что рост подвергшихся воздействию на 7 день после инокуляции опухолей замедляется или останавливается после внутриопухолевого введения ICG и лазерного облучения (798 нм, 800 мВт/см2, 2 минуты) до примерно 15 дня после инокуляции.