Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. С целью выбора оптимальных моделей для экспериментальной проверки гипотезы о том, что все флавоферменты способны генерировать АФК при определенном соотношении окисленного и восстановленного субстрата – донора электронов, проведен теоретический (базы данных PubMed, Uniprot, Human Protein Atlas и Bio GPS), биохимический и вестерн-блот анализ уровня (белок и/или mRNA) и активности нескольких флавиновых дегидрогеназ (цитохром-b5-редуктаза (Cyb5R3), глутатионредуктаза (GSR), глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (G3PDH), сукцинатдегидрогеназа (SDH), дигидрооротатдегидрогеназа (DHODH)) с различной внутриклеточной локализацией в органах и тканях крыс и клеточных линиях. В качестве моделей были выбраны изолированные митохондрии из печени и мозга крыс, безъядерные гомогенаты печени и мозга, первичные гепатоциты, клеточные линии H9c2, C2C12 и K562, коммерческий препарат GSR. Критериями выбора были высокая активность дегидрогеназы интереса в биологической ткани, клеточной линии или образце фермента; простота и доступность модели или процедуры получения; удобство в работе. 2. В отобранных моделях были изучены условия генерации СА и Н2О2, а также возможность гиперпродукции АФК (вспышек) при изменении редокс потенциал и концентрации доноров электронов в присутствие и отсутствии акцептора. Установлено, что НАД(Ф)Н-зависимые флавоферменты Cyb5R3 и GSR не генерируют СА с детектируемой скоростью при всех протестированных концентрация субстрата-донора электронов и его редокс потенциале. Генерация СА и Н2О2 системами DHODH и G3PDH увеличивалась с увеличением концентрации субстратов-доноров электронов и снижением их редокс потенциала без детектируемых вспышек генерации. Характер модуляции продукции субстратами и ингибиторами комплексов дыхательной цепи, а также разобщителем, говорит об участии комплексов III и I в генерации АФК. Сукцинат (субстрат SDH) дозозависимо стимулировал генерацию H2O2 в интактных митохондриях в присутствие и отсутствии ротенона (т.е. в сегменте CII-CIII). При изменении редокс потенциала пары сукцинат/фумарат от 0 до 60 mV в пермеабилизованных митохондриях наблюдалось увеличение генерации СА. Наиболее высокий уровень генерации, который можно назвать «вспышка», наблюдался при добавлении пары сукцинат/малонат (2.5 и 10 mM, соответственно). Ингибиторы i- и o-центров комплекса III дыхательной цепи устраняли зависимость продукции СА от редокс потенциала. В присутствие ингибиторов p- и d-центров комплекса II эффект сохранялся или усиливался, соответственно. Наибольшая скорость генерации СА наблюдалась при одновременном ингибировании внешних Q-связывающих центров комплексов II и III в присутствие пары сукцинат/малонат. Эти данные говорят о том, что в сложных флавин-содержащих комплексах одноэлектронные утечки на кислород могут возрастать при снижении уровня субстратов дыхания. Таким образом, из пяти протестированных флавоферементов только один продемонстрировал способность генерировать СА в виде вспышек и еще два продуцировать его в линейном режиме. Полученные результаты позволили скорректировать направление исследований, и получить следующие, наиболее интересные, на наш взгляд, результаты. 3. В экспериментах с длительной регистрацией продукции АФК митохондриями была исследована природа обнаруженной асимметрии изменения скоростей продукции СА и H2O2 при изменении функционального состояния митохондрий. В частности, был изучен эффект открывания неспецифической митохондриальной поры (mPTP) на генерацию СА и H2O2 в митохондриях, в присутствие различных субстратов дыхания. Также, исследовали эффект субстратов дыхания и окислительного фосфорилирования на продукцию АФК митохондриями в условиях подавления открывания mPTP. Кроме того, был изучен эффект увеличения протонной проницаемости мембраны в генерации СА и H2O2 разными редокс центрами митохондрий. Установлено, что в некоторых условиях, скорость генерации СА являлась зеркальным отражением скорости продукции H2O2, что говорит о возможности исключений из правила генерации АФК митохондриальными системами: СА => H2O2 => другие АФК. Вспышки СА происходили при открывании mPTP и сопровождались подавлением генерации H2O2. В условиях подавления открывания mPTP, резкое ускорение продукции СА происходило при истощении субстратов дыхания и сопровождалось быстрым снижением скорости продукции H2O2. Увеличение концентрации субстратов дыхания и присутствие сопрягающих агентов (ADP/ATP) усиливало генерацию H2O2 в нескольких редокс центрах митохондрий при одновременном подавлении генерации СА. Эти данные говорят о том, что, по крайней мере, в некоторых редокс центрах дыхательной цепи, паттерн генерации АФК соответствует правилу: высокая степень восстановленности – генерация H2O2, пониженная степень восстановленности – генерация СА. Если полученные данные будут подтверждены другими методами/зондами на СА, то это будет означать принципиальную возможность существования СА- и H2O2 –селективных типов редокс сигналинга в клетке. Эти результаты опубликованы DOI: 10.3390/antiox13111317. 4. Изучена относительная мощность продукции (вспышки) АФК внешними флавоферментами дыхательной цепи (дигидрооротатдегидрогеназа и глицерол-3-фосфатдегидрогеназа) и возможность её детекции в безъядерных гомогенатах печени и мозга крыс, и в пермеабилизованных клетках С2С12. Вклад этих систем в общую генерацию АФК в данных условиях был очень низким, а в случае дигидрооротатдегидрогеназы, ниже порога обнаружения. Разработан протокол для модуляции редокс состояния митохондриальных дыхательных субстратов и детекции продукции СА/ H2O2 в интактных клетках.