Анализ рисков для млекопитающих при воздействии экотоксикантов группы полихлорированных бифенилов (моно-, ди- и трихлорированные конгенеры)

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-24-00498

НазваниеАнализ рисков для млекопитающих при воздействии экотоксикантов группы полихлорированных бифенилов (моно-, ди- и трихлорированные конгенеры)

Руководитель Егорова Дарья Олеговна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук , Пермский край

Конкурс №89 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые слова полихлорированные бифенилы конгенеры бактерии деструкция токсичность млекопитающие мышь

Код ГРНТИ34.27.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Представленный проект посвящен изучению вопросов, связанных с экологической безопасностью. Концепция устойчивого развития, реализуемая мировым сообществом, направлена на создание благоприятных условий жизни как для нынешних, так и для последующих поколений. В этом направлении особую актуальность приобретают исследования, направленные на разработку природоподобных технологий, позволяющих решать экологические проблемы экономически эффективно и безопасно для окружающей среды и ее обитателей. Одной из актуальных проблем является негативное влияние на природу и животных синтетических органических соединений группы Стойкие органические загрязнители (СОЗ), в том числе полихлорированных бифенилов (ПХБ). ПХБ вызывают ряд тяжелых заболеваний, связанных с нарушением функций сердечно -сосудистой, нервной и репродуктивной систем организма млекопитающих. Известно, что ПХБ выпускались в виде смесей, содержащих как низко так и высоко хлорированные конгенеры. Основное внимание уделяется воздействию на животных и человека высоко-хлорированных бифенилов. Однако, низко хлорированные конгенеры ПХБ также могут оказывать негативное воздействие, при этом их содержание в окружающей среде обусловлено не только проникновением в природу из промышленных смесей, но и образованием в результате анаэробной деструкции высоко хлорированных бифенилов. Показано, что разложение ПХБ с применением аэробных бактерий – одно из наиболее перспективных направлений развития экотехнологий. Однако, успешность решения зависит от ряда факторов и требует комплексного подхода. Необходимо оценивать как эффективность биотрансформации ПХБ, находящихся в окружающей среде, так и возможность образования и поступления во внешние среды продуктов метаболизма. При этом крайне мало данных о воздействии на организм животных и человека хлорбифенилов, содержащих от 1 до 3 заместителей в молекуле. В рамках настоящего проекта предлагается комплексный подход к оценке возможности очистки природных сред с помощью экобиотехнологий, основанных на биодеградативном потенциале аэробных бактерий (а именно выявление и изучение уникальных штаммов, осуществляющих утилизацию хлорбифенилов до продуктов основного обмена клетки), при этом с параллельной оценкой воздействия хлорбифенилов и продуктов их биоконверсии на состояние мышей, как представителей класса Млекопитающих. Полученные результаты позволят повысить эффективность оценки рисков для животных и людей при анализе экологического состояния территорий, загрязненных хлорированными бифенилами.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Одной из актуальных проблем современности является воздействие на организм человека и животных органических синтетических соединений, а также их производных, образующихся в окружающей среде под действием природных факторов. Одной из групп особо опасных соединений являются полихлорированные бифенилы (ПХБ). Известно, что ПХБ оказывают негативное воздействие на здоровье человека и животных в низких дозах. Однако, основные исследования в этом направлении посвящены высокохлорированным бифенилам. Негативный потенциал низкохлорированных конгенеров остается мало изученным. Кроме того, под воздействием биотических факторов в окружающей среде из ПХБ образуются гидроксилированные производные, которые также могут нести угрозу для млекопитающих и других животных. В настоящем исследовании за 1 год выполнения проекта установлено, что низкохлорированные бифенилы (моно- и ди-замещенные) угнетают гуморальный иммунитет млекопитающих (снижение показателей антителообразующих клеток в селезенке в 0,72 – 0,85 раза), вызывают в печени признаки продуктивной воспалительной реакции, распространенной белковой дистрофии с признаками некроза. Однако, продукты бактериальной деструкции, образующиеся при аэробной трансформации моно- и дихлорированных бифенилов под действием ферментов аэробных бактерий, не вызывают таких негативных явлений при поступлении в организм млекопитающих. В настоящей работе на основе скрининга 250 бактериальных штаммов показано, что аэробные бактерии-деструкторы хлорбифенилов являются обитателями различных ценозов, отличающихся спектром и уровнем загрязнения. Отобранные штаммы-деструкторы хлорбифенилов (100 штаммов) принадлежат родам родам Achromobacter, Acinetobacter, Bacillus, Brevundimonas, Brevibacterium, Bosea, Delftia, Kocuria, Leucobacter, Micrococcus, Ochrobactrum, Pseudomonas, Rhodococcus и Stenotrophomonas. Доминирующее положение (31.1 %) занимают представители рода Achromobacter. Эффективность деструкции монохлорированных бифенилов составила 0.27–100 %, дихлорбифенила – 25.8–99.3 %, трихлорбифенилов – 38.4–98.3 %. Основными метаболитами являлись бензойная, моно-, ди- и трихлорбензойные кислоты. На основании количественной оценки установлено, что образующиеся (хлор)бензойные кислоты не являются конечным продуктом метаболизма, а подвергаются дальнейшей трансформации. Ключевым ферментом аэробного бактериального окисления хлорбифенилов является бифенил диоксигеназа, кодируемая геном bphA. В результате скрининга 40 активных штаммов-деструкторов хлорбифенилов, ген bphA выявлен у 15 штаммов. Нуклеотидная последовательность гена проанализирована у 11 штаммов. Установлено, что уровень сходства с геном bphA штаммов-деструкторов, описанных ранее и выделенных из территориально близких экотопов составляет 82.32–99.76 %. Анализ гена bphA штаммов рода Rhodococcus, показал, что уровень сходства с данным геном известных штаммов-деструкторов ПХБ рода Rhodococcus составляет 95.1–97.06 %. При визуализации филогенетического положения выявленных генов установлено, что bphA штаммов-деструкторов, отобранных в настоящем исследовании, формируют самостоятельную ветвь на филогенетическом дереве. Полногеномный анализ штамма FGX, выделенного из бифенил-деградирующей ассоциации FG-B, что штамм принадлежит к роду Kokuria, размер генома составляет 4016717 пн, содержание GC - 72.5 %. В составе генома выявлены гены/опероны, обуславливающие разложение бензойной и гидроксибензойных кислот, а также катехола и хлоркатехолов до соединений основного обмена клетки. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что низкохлорированные бифенилы также опасны для здоровья млекопитающих, как и высокохлорированные. При этом аэробная бактериальная деструкция хлорбифенилов является актуальным природным механизмом, обуславливающим снижение негативной нагрузки на животных при загрязнении окружающей среды хлорбифенилами. Выявленные и исследованные штаммы-деструкторы могут быть использованы как основа для разработки природоподобных технологий по очистке окружающей среды от хлорбифенилов.

Публикации

1. Егорова Д.О., Кирьянова Т.Д., Королев Н.А. The Genetic Basis of the Biotechnological Potential of Aerobic PCB-Degrading Strains Edited Collection of selected papers with the title «Plants and Microorganisms: Biotechnology of the Future» by the Cambridge Scholars Publishing Ltd. (Cambridge, U.K.). (год публикации - 2025)

2. Королев Н.А., Кирьянова Т.Д., Егорова Д.О. Распространенность ПХБ-деградативной активности среди штаммов аэробных бактерий, выделенных из различных экониш Инновационные биотехнологии для охраны окружающей среды: от теории к практике : материалы I Междунар.науч.-практ.конф. (Минск, 23-25 апреля 2024г.)/орг.ком.конф.:А.А. Шепшелев (пред.) и [др.]. Минск: ИнМи. , 2024. С. 23-25. (год публикации - 2024)

3. Егорова Д.О., Королев Н.А., Кирьянова Т.Д. Биодеградативный потенциал штаммов, изолированных из ассоциации бактерий спутников прохлорофита Prochlorothrix scandica Innovations in Life Sciences: сборник материалов VI Международного симпозиума, г. Белгород, 22-24 мая 2024 г. / отв. ред. А.А. Присный. - Белгород: ИД "БелГУ" НИУ "БелГУ", 2024. 476 с., 2024. С. 39-40. (год публикации - 2024)

4. Кирьянова Т.Д. Моделирование белковой структуры α-субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназы (BphA1) штамма R. wratislaviensis CН628 Вестник Пермского университета. Серия Биология., 2025. Вып. 1. С. 32-42. (год публикации - 2025)
10.17072/1994-9952-2025-1-32-42

5. Королев Н.А., Кирьянова Т.Д., Егорова Д.О. Разнообразие культивируемых бактерий-деструкторов монохлорированных бифенилов в почвах охраняемого ландшафта Вестник Пермского университета. Серия Биология., 2024.Вып. 3. С. 279-293. (год публикации - 2024)
10.17072/1994-9952-2024-3-285-299

6. Егорова Д.О., Кирьянова Т.Д., Королев Н.А. Генетическая основа биотехнологического потенциала аэробных штаммов-деструкторов ПХБ материалы IV Международной научной конференции «Растения и микроорганизмы: биотехнология будущего» PLAMIC2024. Иркутск. Издательство ИГУ. , 2024. С. 129 – 131. (год публикации - 2024)

7. Кирьянова Т.Д., Егорова Д.О. Особенности разложения моногидроксибифенилов аэробными штаммами, изолированными из бактериальных ассоциаций–деструкторов ароматических поллютантов Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки., 2024. Т. 166, кн. 3. С. 459–475. (год публикации - 2024)
10.26907/2542-064X.2024.3.459-475

8. Королев Н.А., Кирьянова Т.Д., Егорова Д.О. Биодеструкция ПХБ 8 штаммами аэробных бактерий Защита окружающей среды от экотоксикантов: международный опыт и российская практика: материалы VI международной научно-технической конференции, посвященной 20-летию кафедры «Прикладная экология» УГНТУ (09 апреля 2024 г.) /редкол.: И.Г. Мигранова и др.. Уфа: УНПЦ «Изд-во УГНТУ», , 2024. С. 108-110. (год публикации - 2024)

9. Королев Н.А., Кирьянова Т.Д., Егорова Д.О. Биодеструкция монохлорированных бифенилов штаммами аэробных бактерий Сборник тезисов X Всероссийской Пущинской конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», 2024. (год публикации - 2024)

10. Егорова Д. О., Гейн С. В., Королев Н. А., Логинова Н. П. Орто- и мета-монохлорированные бифенилы угнетают гуморальный иммунитет и оказывают токсическое воздействие на клетки печени мышей Acta Naturae, Т. 17, № 3(66) (год публикации - 2025)
10.32607/actanaturae.27596

11. Егорова Д.О., Гейн С.В., Королев Н.А., Кирьянова Т.Д. Оценка рисков здоровью и влияния на иммунитет 2,4’-дихлорбифенила (ПХБ 8) и продуктов его бактериальной деструкции при пероральном поступлении в организм Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки. , кн. 1 (год публикации - 2026)

12. Кирьянова Т.Д., Королев Н.А., Егорова Д.О. Штамм Rhodococcus opacus FG1 – психротолерантный деструктор моно-, ди- и трихлорированных бифенилов Microbiology, V. 95. №3 (год публикации - 2026)

13. Кирьянова Т.Д., Королев Н.А., Егорова Д.О. Филогенетическое разнообразие и биодеградативный потенциал штаммов-деструкторов моно-, ди- и трихлорированных бифенилов Волгоград: Библиотечно-издательский центр ВолгГМУ, 5-й Российский Микробиологический конгресс: сборник тезисов докладов; Волгоград, 29 сентября – 3 октября 2025 г. / под ред. Д.А. Бабкова. – Волгоград: Библиотечно-издательский центр ВолгГМУ, 2025. С. 110–111. (год публикации - 2025)

14. Кирьянова Т.Д. Анализ полногеномной нуклеотидной последовательности штамма СН628, деструктора ароматических соединений Пущино: ФИЦ ПНЦИБИ РАН, Сборник тезисов 28-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА». Пущино: ФИЦ ПНЦБИ РАН, 2025. С. 46 – 47. (год публикации - 2025)

15. Королев Н.А., Егорова Д.О., Гейн С.В. Поллютант группы СОЗ (4-хлорбифенил) и продукты его биодеструкции как источник негативного влияния на иммунитет млекопитающих (на примере белых мышей Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Материалы ХХ Всероссийской научной конференции молодых ученых с международным участием «Экологическая безопасность в условиях антропогенной трансформации природной среды», посвященной памяти Г.А. Воронова, Н.Ф. Реймерса и Ф.Р. Штильмарка. 2025. С. 272-276. (год публикации - 2025)

16. Кирьянова Т.Д., Королев Н.А., Егорова Д.О. Филогенетическое разнообразие штаммов-деструкторов ПХБ, изолированных из экониш с техногенной нагрузкой. Уфа: УИБ УФИЦ РАН, Экобиотех-2025. Материалы VIII Всероссийской конференции с международным участием, г. Уфа 1-4 октября 2025 г. – Уфа: УИБ УФИЦ РАН, 2025. С. 88. (год публикации - 2025)

17. Егорова Д.О. Особенности генетических детерминант штаммов рода Rhodococcus, обусловливающие их ПХБ-деградативный потенциал Уфа: УИБ УФИЦ РАН, Экобиотех-2025. Материалы VIII Всероссийской конференции с международным участием, г. Уфа 1-4 октября 2025 г. – Уфа: УИБ УФИЦ РАН, 2025. С. 71 (год публикации - 2025)

18. Королев Н.А., Кирьянова Т.Д. Метаболические особенности биотрансформации 2,4,6-трихлорбифенила штаммами аэробных бактерий Пущино: ФИЦ ПНЦБИ РАН, Сборник тезисов 28-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА». 2025. С. 289–290. (год публикации - 2025)

19. Королев Н.А., Кирьянова Т.Д., Егорова Д.О. Bacterial degraders as the Basis for Nature-like Technology for the Processing of Trichlorinated Biphenyls (Persistent Organic Pollutants) Springer Nature Switzerland AG, Advances in Ecology and Environmental Engineering II Proceedings of International Conference on Ecology and Environmental Engineering (March 24–27), 2025, Sochi, Russia. Part of the book series: Springer Proceedings in Earth and Environmental Sciences. 02.01.2026 (год публикации - 2026)
https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-031-99762-4_40

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В результате проведенных исследований в 1 год выполнения проекта для более подробного изучения был выбран штамм FG1, идентифицированный на основании анализа гена 16S рРНК, как представитель рода Rhodococcus. Филогенетический анализ на основании полногеномной последовательности показал, что наиболее филогенетически близким является штамм Rhodococcus opacus ATCC 51881 (GenBank PRJNA622446) (сходство по ANI 99.06% с перекрытием геномов 83,63%; по AAI – 99.58%). Установлено, что в геноме штамма FG1 присутсвуют опероны, обусловливающие разложение бифенила, бензойной кислоты и ряда ароматических соединений. Выявлено два оперона, в который включены гены «верхнего» окисления бифенила/ПХБ. Следует отметить, что последовательность генов в одном опероне совпадает с таковой у штаммов R. оpacus KT112-7 и R. jostii RHA1, однако отличается от остальных представителей штаммов-деструкторов ПХБ рода Rhodococcus. Последовательность bph-генов во втором опероне штамма FG1 является уникальной. Последовательность генов bphD, bphC, bphE, bphG и bphF совпадает с таковой генов в bph-оперонах штаммов R. оpacus KT112-7 и R. jostii RHA1. Следует отметить, что гены «верхнего» пути деструкции бифенила штаммов KT112-7 и RHA1 расположены на плазмидах, тогда как у штамма FG1 – на хромосоме. Ключевым ферментом деструкции бифенила/ПХБ является бифенил диоксигеназа, каталитический центр которой располагается на α-субъединице (ген bphA1). В результате визуализации сходства нуклеотидных последовательностей генов bphA1, выявленных у штамма FG1, установлено, что выявленные последовательности располагаются в разных ветвях филогенетического дерева. Одним из основных продуктов разложения бифенила /ПХБ аэробными бактериями является бензойная/хлорбензойная кислота. Установлено, что последовательность генов в ben-опероне штамма FG1, совпадает с таковой в опероне известного штамма-деструктора ПХБ R. jostii RHA1 (Pieper, Seeger, 2008), а нуклеотидная последовательность гена benА штамма FG1 наиболее близка к гену benA штамма R. opacus 1CP, известного деструктора ароматических соединений (Konig et al., 2004). Известно, что на биодеградативную активность штаммов в естественной среде влияет ряд физико-химических факторов. В связи с этим, что бы оценить перспективность применения штамма-деструктора для биоремедиационных природоподобных технологий, необходимо изучить его реализованную деградативную активность. В результате проведенных исследований было установлено, что штамм FG1, проявляет высокую активность в отношении (моно-три)-ХБ (деструкция 78,2–100%) в присутствии более доступного источника углерода - глюкозы. Таким образом, можно предположить, что наличие в окружающей среде соединений, являющихся легкодоступным субстратом, не будет существенно снижать биодеградативную активность исследованного штамма. Присутствие высоких концентраций солей на загрязненных территориях является фактором, ограничивающим применение биоремедиационных технологий, основанных на использовании аэробных бактерий. В связи с этим, в настоящем проекте была исследована деградативная активность штамма FG1 в отношении (моно-три)-ХБ в условиях засоления. Установлено, что значимое снижение эффективности деструкции ди- и три-ХБ начинается при концентрации NaCl в среде равной 40 г/л. Так при концентрации 0–30 г/л NaCl в среде, разложение ди- и три-ХБ составило 76,9–99,1 %, а в присутствии 40 г/л NaCl – 9,1–66,7 %. Следует отметить, что штамм FG1 разлагал 100 % монохлорбифенилов на всем исследованном диапазоне концентраций засоления среды. Температурный фактор является одним из определяющих при проведении работ по очистке природных территорий от загрязнения. В настоящем исследовании установлено, что штамм FG1 проявляет деградативную активность в широком диапазоне температур. Так показано, что при низких температурах (4–10ºС), эффективность биодеструкции (моно-три)-ХБ составила 75–100%, что выше, чем аналогичный показатель, описанный в работах (Michaud et al., 2007; Papale et al., 2017). В среднем температурном диапазоне (20–30ºС) штамм FG1 трансформировал 89,8–100% (моно-три)-ХБ, не уступая по данному показателю известным штаммам-деструкторам (Gorbunova et al., 2024). Повышение температуры культивирования от 40ºС до 50ºС привело к снижению деградативной активности исследуемого штамма до 83,6–99,4%. При температуре 60ºС разложение хлорбифенилов не зафиксировано. Таким образом, штамм R. opacus FG1 эффективно разлагает (моно-три)-ХБ в широком диапазоне изменений условий культивирования по ряду физико-химических показателей, что делает его перспективным для применения в природоподобных технологиях, направленных на очистку ПХБ-загрязненных территорий. Высоко- и среднехлорированные бифенилы вызывают нарушения в развитии плода животных, заболевания кожи и нервной системы, рассматриваются как одна из причин возникновения диабета, а также провоцируют развитие опухолевых заболеваний и генетических нарушений [Lan et al., 2023, Miletić et al., 2023]. Однако вопрос о значимости низкохлорированных бифенилов для здоровья животных и человека в настоящий момент остается открытым. Основным направлением для предотвращения перемещения ПХБ по пищевым цепям является их биодеструкция в природных средах, обусловленная деятельностью ферментативных систем аэробных бактерий. При этом образуются гидроксилированные производные хлорбифенилов и хлорбензойные кислоты, которые также могут вызывать негативные эффекты при поступлении в организм млекопитающих [Rengelshausen et al., 2023]. В рамках представленного исследования установлено, что 2,4,4’-триХБ, 2,4,2’-триХБ и 2,4,6-триХБ в эксперименте in vivo статистически значимо снижали количество АОК в селезенке как по относительным, так и абсолютным показателям, при этом выраженность реакции ГЗТ под воздействием исследуемых соединений увеличивалась. Продукты биодеструкции, образовавшиеся за 7 суток эксперимента по разложению триХБ штаммом R. opacus FG1, оказывали незначительное угнетающее действие на гуморальный иммунитет, но не влияли на показатели клеточно-опосредованного иммунитета. В результате биодеструкции 2,4,4’-триХБ, 2,4,2’-триХБ и 2,4,6-триХБ в течение 14 суток, образовавшаяся смесь метаболитов не представляла угрозу для иммунитета мышей. Гистологический анализ печени показал, что 2,4,4’-триХБ, 2,4,2’-триХБ и 2,4,6-триХБ и продукты их 7 сут. биодеструкции вызывают дистрофические изменения в ткани, тогда как продукты 14 сут биодеструкции не оказывают негативного воздействия. Таким образом, впервые показаны эффекты, оказываемые 2,4,4’-триХБ, 2,4,2’-триХБ и 2,4,6-триХБ на иммунитет и морфологическое состояние печени млекопитающих (на примере мышей), а также установлено, что разложение данных конгенеров штаммом FG1, обусловливает нивелирование негативного воздействия.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта открывают перспективы для разработки биоремедиационных технологий очистки почв от полихлорбифенилов (ПХБ), загрязняющих промышленные и сельскохозяйственные территории России. Представленные в работе штаммы, в том числе Rhodococcus opacus FG1, демонстрируют высокую эффективность деградации моно-, ди- и трихлорбифенилов (до 100%) в широком диапазоне физико-химических условий (температура 4–50°C, соленость до 30 г/л NaCl, присутствие глюкозы), что позволяет применять их в природоподобных системах для восстановления экосистем. Полученные данные формируют научный задел для создания микробных ассоциаций, ускоряющих сукцессионные процессы в почвенных микробиоценозах под давлением ксенобиотиков. Внедрение штаммов в биотехнологии обеспечит экономический рост за счет снижения затрат на рекультивацию загрязненных земель. Например, традиционные методы очистки ПХБ-загрязненных территорий (например, на объектах типа Дзержинск) стоят в 5–10 раз дороже биодеградации. Геномный анализ (bphA, benA опероны) и данные по иммунотоксичности метаболитов подтверждают безопасность возможных технологий на основе изученных штаммов, и закладывают основу для патентов на штаммы и биотехнологии, основанные на данных. Социальный эффект проявляется в повышении качества почв и продуктов питания, минимизируя накопление ПХБ в пищевых цепях и риски для здоровья (иммуносупрессия, рак, генотоксичность), подтвержденные in vivo тестами на мышах. Разработка мобильных биоремедиаторов для засоленных и холодных регионов (Сибирь, Арктика) способствует устойчивому развитию сельского хозяйства и защите населения, интегрируясь в нацпроекты "Экология" и "Наука".