Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Работы первого года Проекта были посвящены поиску сочетаний генетический кодируемых активаторов НК клеток и проведению работ на мышиных моделях для определения наиболее эффективных и синергичных комбинаций. Использовали двухопухолевую модель которая позволяет определить потенциал абскопального эффекта от проводимого иммунотерапевтического вмешательства. Был проведен выбор наиболее оптимальных сочетаний активаторов ИКТ + НК-активаторов исходя из практических соображений – удобства использования и информативности предполагаемых результатов. Наиболее оптимальными было сочтено использование поверхностных маркеров при проведении проточной цитометрии (FACS). Рецепторы иммунных клеток человека и мыши имеют довольно большие различия, в особенности НК-клеток, которые так же отличаются не только по маркерам созревания, но и могут зависеть от линии мышей. Провели анализ различий в иммунных маркерах у разных линий мышей, чтобы эти результаты можно было использовать для создания различных панелей иммунофенотипирования клеток иммунной системы и составлена карта тепловых значений. По итогам проведенной работы готовится публикация. Предположили, что стресс индуцируемый лиганд Rae1d, должен хорошо дополнять действие OX40L и 4-1BBL. Увеличение IFN-γ при ИКТ терапии, учитывая его потенциал в противоопухолевой терапии так же предполагало возможность синергичного с ИКТ действия. Получили генетически модифицированные клеточные линии (ГМ-линии), для чего использовали трансдукцию с лентивирусами, несущими экспрессионные кассеты содержащие активаторы ИКТ (mOX40L и m4-1BBL), НК-активатор (Rae1d) и mIFN-γ отдельно и в разных сочетаниях. Всего получено 6 ГМ линий 1) СТ26/EGFP, 2) СТ26/mOX40L, 3) СТ26/mRae1d, 4) СТ26/mOX40L-mRae1d, 5) СТ26/mIFNg, 6) СТ26/mOX40L-mIFNg. Провели эксперименты на мышиной модели BALB/c-CT26 с использованием двухопухолевой инокуляции. На один бок всем мышам прививали клетки дикого типа СТ26wt, а на противоположный один из вариантов 1) СТ26wt, 2) СТ26/EGFP, 3) СТ26/mOX40L, 4) СТ26/mRae1d, 5) СТ26/mOX40L-mRae1d, 6) СТ26/mIFNg, 7) СТ26/mOX40L-mIFNg. Это позволило оценивать влияние генетически кодируемых иммунных активаторов находящихся в одной опухоли на рост нативной, не модифицированной опухоли. Тем самым оценивать потенциальный абскопальный эффект использованных генетических активаторов. Показано, что при использовании mOX40L и mIFNg, экспрессирующие их опухоли практически не развиваются, при этом практически никакого влияния не оказывается на противоположную нативную опухоль. Опухоли с mRae1d развивались, однако тормозили нативные опухоли CT26WT, т.е. обладали потенциальным абскопальным эффектом. СТ26/mOX40L-mRae1d обладала наибольшим потенциалом как для подавления собственных опухолей, так и противоположных, т.е. наблюдали синергичный эффект. Провели оценку функционального статуса иммунной системы используя антитела к маркерам: CD3 (Т-клетки), CD8a (цитотоксические Т-клетки), CD4 (T-хелперы), NKG2D (NK-клетки и активированные CD8 Т-клетки), CD107a (цитотоксические NK и T-клетки), конъюгированныe с флуорофорами необходимыми для дифференциальной детекции популяций иммунных клеток крови мыши. Провели анализ популяций иммунных клеток крови мышей линии Balb/c при влиянии генетически кодируемых иммунных активаторов, при отборе крови из ретроорбитального синуса глаза мыши под изофлурановым наркозом, после чего мышь оставалась в эксперименте. Показаны отличия в популяциях иммунных клеток крови мыши ответивших (СТ26/mOX40L-mRae1d, нет опухоли) и не ответивших CT26wt (большие опухоли) на действие иммуноактиваторов по отношению к интактным животным. Так, в группе не ответивших на воздействие (CT26wt), показан наиболее высокий уровень разных цитотоксических клеток NKG2D+ CD107a+, а для ответивших на терапию наоборот – самый низкий.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В ходе выполнения проекта были проведены комплексные in vivo исследования, направленные на преодоление ключевых ограничений современной иммунотерапии рака на основе иммунных контрольных точек – ограниченной доли ответа у пациентов и системной токсичности. Основное внимание было уделено разработке и сравнительной оценке стратегий локального усиления иммунного ответа, активируемого через костимулирующий рецептор OX40, что является перспективной альтернативой или дополнением к терапии ингибиторами контрольных точек. Центральным методологическим достижением стала разработка и валидация стандартизированного подхода к мониторингу системного иммунного статуса в ходе терапии. Нами был предложен и апробирован метод проточного цитометрического иммунопрофилирования малых объемов периферической крови, позволяющий проводить прижизненный продольный анализ иммунных состояний без необходимости забора тканей опухоли. Ключевым аспектом этой работы стало решение проблемы видовых и штаммовых различий в маркерах иммунных клеток, в частности, естественных киллеров (НК-клеток). Были определены принципы формирования панели для исследования состояния иммунного статуса на основе консервативных функциональных маркеров (таких как NKG2D, CD107a), пригодных для межвидового сравнения и оценки активации врожденного иммунитета. Эта методология с использованием периферической крови как «жидкой биопсии» была успешно интегрирована в последующие in vivo эксперименты, позволив динамически и сопоставимо оценивать изменения в пулах циркулирующих иммунных клеток у животных-респондеров и не-респондеров, закладывая основу для поиска прогностических биомаркеров. Вторым направлением работ стала детальная проверка гипотезы о модулирующей роли опухолевого микроокружения, в частности, фибробластов, в эффективности иммунотерапии. Ранее нами была создана и охарактеризована модель строма-обогащенной опухоли получаемой путем ко-инокуляции сингенных раковых клеток и фибробластов. Используя эту модель, мы продемонстрировали, что присутствие фибробластов создает более благоприятные условия для индуцирования полной регрессии опухоли при активации пути OX40/OX40L. Принципиально важным результатом явилось доказательство того, что данный усиливающий эффект не зависит от технологической платформы доставки терапевтического гена. Одинаково значимое повышение эффективности было подтверждено как при использовании генетически модифицированных опухолевых клеток, стабильно экспрессирующих OX40L, так и при локальной инъекции невирусного полимерного комплекса (PEG-PEI-TAT), доставляющего плазмидную ДНК с геном OX40L. Это указывает на фундаментальность наблюдаемого биологического феномена: фибробласты в микроокружении, вероятно, выступают в роли дополнительного источника иммуностимулирующих сигналов или способствуют более эффективному презентированию опухолевых антигенов, усиливая запускаемый OX40L адаптивный иммунный ответ. Наиболее значимым научным результатом стало прямое сравнительное исследование трех стратегий усиления терапии, основанной на OX40L: через модификацию микроокружения фибробластами, неспецифическую стимуляцию адъювантом и целенаправленную активацию NK-клеток. Эксперименты на моно- и билатеральных опухолевых моделях («горячая» CT26 и «холодная» 4T1) показали, что все три подхода способны влиять на локальный и системный (абскопальный) противоопухолевый ответ. Строма-обогащенная модель хоть и была наиболее эффективна по достижению показателей торможения роста опухоли и увеличению выживаемости, однако требует очень глубоких исследований для возможности практического применения. Модели с использованием адъювантов оказались сильно зависимыми от дозирования препарата для избегания иоНЯ, и показали разнонаправленные эффекты в зависимости от использованных моделей. Эксперименты на мышах Nu/J с нефункциональным адаптивным иммунитетом, позволили выявить универсальный и наиболее эффективный механизм. Им оказалась синергия между костимуляцией T-клеток (через OX40L) и активацией врожденного иммунитета через рецептор NKG2D с помощью его лиганда Rae1d. Именно комбинация генетически кодируемых молекул OX40L + с НК-cтимулятором продемонстрировала максимальную эффективность в подавлении роста как первичной, так и отдаленной опухоли, показала активность в резистентной модели и была единственной, вызвавшей выраженный абскопальный эффект у мышей с отсутствующими T-клетками. Это прямо свидетельствует о том, что критическим условием для преодоления локальной иммуносупрессии и формирования мощного системного ответа является одновременное задействование адаптивного (через костимулирующие чекпойнты) и врожденного (через таргетные активаторы NK-клеток) звеньев иммунитета. Общее заключение и перспективы Проведенные работы вносят существенный вклад в развитие принципов рационального дизайна комбинированной иммунотерапии. Во-первых, мы внедрили и апробировали методологию мониторинга терапии через анализ циркулирующих иммунных клеток, что является важным шагом к персонализации лечения и определению его функциональных исходов. При этом паттерны изменений пулов иммунных клеток могут быть исследованы в доклинических моделях с возможной трансляцией в клинику. Во-вторых, мы установили, что усиление иммунотерапии за счет элементов микроокружения (фибробластов) является воспроизводимым эффектом, не зависящим от конкретной технологической платформы, что расширяет возможности для его трансляции. В-третьих, и это главный вывод, нами была экспериментально определена и обоснована универсальная стратегия преодоления резистентности к терапии. Комбинация активатора адаптивного иммунитета (OX40L) с таргетным активатором врожденного иммунитета (NK-engager, такой как Rae1d) создает мощный синергический эффект, необходимый для индукции системного противоопухолевого ответа даже в условиях иммунологически «холодных» опухолей. Хотя эффект и теряется при вытитровке иммуноактивирующих молекул, предполагая, что необходимо дополнительно воздействовать на формирование противоопухолевой иммунной памяти. Полученные данные формируют прочную научную основу для разработки нового поколения иммунотерапевтических препаратов, основанных на согласованной активации множественных звеньев иммунной системы, что открывает путь к повышению эффективности лечения при минимизации рисков системной токсичности.