Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Картирование положения LepA-связанных рибосомных субчастиц на LepA-зависимых мРНК с помощью селективного рибосомного профайлинга является одним из способов исследовать функцию LepA. Ожидается, что такой подход определит стадии трансляции, которые проходят с участием белка LepA и набор LepA-зависимых матриц. Это в свою очередь позволит понять роль белка LepA в трансляции. Отбор рибосомных комплексов, ассоциированных с белком LepA, планируется проводить с помощью антител против FLAG эпитоп. Для этого, используя технику «recombineering», были проведены эксперименты по созданию lepА-модифицированного штамма E.coli, у которого в хромосомном гене lepA на 5´-конце интегрирована нуклеотидная последовательность FLAG эпитопа (DYKDDDDK пептид). В настоящее время ведется проверка проросших рекомбинантных клеток E.coli на предмет обнаружения аллели lepA< >lepA-FLAG. Для оценки влияния внесенной модификации на активность эндогенного белка LepA-FLAG гидолизовать ГТФ был синтезирован рекомбинантный FLAG-меченный белок LepA в системе Штудиера с экспрессионной плазмиды. На данный момент тестируется ГТФазная активность рекомбинантного белка LepA-FLAG. Этот результат будет экстраполирован на ГТФазная активность эндогенного белка LepA-FLAG. Для интерпретации результатов селективного рибосомного профайлинга в дальнейшем необходимо провести сравнительный анализ селективного и классического рибосомного профилирования штаммов E.coli lepА-модифицированного и дикого типа, соответственно, а также штамма с делецией гена lepA (∆lepA). В отчетном году отработан экспериментальный протокол бактериального рибосомного профилирования штаммов E.coli дикого типа и ∆lepA и процедуры выделения тотальной РНК из клеточных лизатов E.coli. Получено 6 библиотек Ribo-Seq (по три повторности для штаммов E.coli дикого типа и ∆lepA) и 4 библиотеки RNA-Seq (по две повторности для штаммов E.coli дикого типа и ∆lepA). Произведена оценка качества полученных библиотек с помощью ряда биоинформатических программ. Для секвенирования РНК процент полезных прочтений составил в среднем около 40% (5-15 млн прочтений), а для рибосомного профилирования в среднем около 4% (0.06-5млн), что, в целом, говорит о достаточном качестве большинства библиотек.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Отработаны этапы селективного рибосомного профайлинга. Создана функциональная меченая версия белка LepA. Получены плазмиды, экспрессирующие LepA с FLAG-эпитопами (1x, 2x, 3x). Установлено, что 1xFLAG-LepA и 2xFLAG-LepA сохраняют ГТФазную активность. Подобраны условия индукции (IPTG < 0.001 мМ) для достижения близкого к нативному уровня экспрессии. Подтверждена ассоциация 1xFLAG-LepA с 70S рибосомами и эффективность фиксации комплексов сшивающими агентами. Оптимизирован протокол иммунопреципитации, позволяющий специфично выделять рибосомные частицы, связанные с LepA, даже при низкой экспрессии. При проведении биоинформатического анализа выявлено, что делеция lepA приводит к изменению экспрессии 1017 генов (614 подавлены, 403 активированы). Наиболее выражены изменения в метаболических путях глицерол-3-фосфата (снижена экспрессия генов glpABDFKQT) и дыхательной цепи (повышение экспрессии генов цитохром bo₃-оксидазы, cyoAB). Выявлено 884 гена со значимыми изменениями в эффективности трансляции (569 с повышенной, 315 с пониженной). Обнаружены согласованные сдвиги в целых функциональных группах. Подавлена трансляция мембранных транспортеров и насосов (acrE, mdtСEА, emrB, xylGEF), белков периплазмы (ynfF, ynfE, yjcS, torA, ymgD, pbpC, mrdA, efeB, fimC, malS, xylF, dpiB, paoC, ssuA, evgS, ynjB), ферментов метаболизма глицерола (glpABCQ, dhaR, yggF); ферментов катаболизма треонина (tdcBDEG). Усилена трансляция компонентов дыхательной цепи переноса электронов (cyoAD, cydA, sdhBCD, fumC, aceA, lldD); ДНК-связывающих и упаковочных белков (hns, ihfB, hupA); рибосомных белков (rpsJF, rpmCBDFH, rplNE), систем транслокации Sec/Tat. Предложена модель, связывающая изменения транскриптома с реорганизацией нуклеоида, а транслатома — с нарушением биогенеза рибосом. Проведена фенотипическая проверка. Несмотря на подавление эффлюксных насосов acrE и mdtСEА, штамм ΔlepA не показал повышенной чувствительности к антибиотикам, что согласуется с выявленными компенсаторными механизмами. Таким образом, разработан полный цикл методик для рибосомного профайлинга и селективного анализа комплексов LepA. Полученные данные раскрывают системную роль LepA в координации транскрипции, трансляции и клеточного гомеостаза.