Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе выполнения запланированных на 2024 год исследований были получены следующие результаты: 1. Проведен анализ современных представлений о механизмах радиорезистентности раковых клеток (опубликовано в журнале Биофизика, 2024, том 69, № 6, с. 1235–1262). 2. Проведена оценка радиорезистентности клеточных линий человека: A549 (рак лёгких), MCF-7 (рак молочной железы) и Caco-2 (колоректальный рак) с использованием MTT-теста, клоногенного теста и флуоресцентной микроскопии. MTT-тест оказался неприменимым для анализа. Полулетальные дозы (ЛД50) рентгеновского излучения по клоногенному тесту составили: MCF-7 ~4.7 Гр, Caco-2 ~2.5 Гр, A549 ~2.3 Гр. Результаты ЛД50 по флуоресцентной микроскопии (окраска DAPI, FITC-аннексин V, пропидий йодид) составили: MCF-7 ~5 Гр, Caco-2 ~2.7 Гр, A549 ~2.5 Гр. 3. Исследована экспрессия генов пероксиредоксинов (PRDX1-6), генов репарации ДНК и апоптоза в клетках A549, MCF-7 и Caco-2 при дозах облучения 2.5, 5 и 10 Гр. Обнаружено, что в нормальных условиях во всех линиях наиболее активно экспрессируется ген PRDX6, а наименьшая экспрессия наблюдается для PRDX1. В клетках A549 также отмечен относительно низкий уровень PRDX2. Через 2 часа после облучения, экспрессия PRDX1-6 возрастала (5-14 раз) и особенно резко для PRDX1 и PRDX2. Облучение высокими дозами (5 и 10 Гр) приводило к двухфазной индукции (1-й и 4-й час) экспрессии генов репарации ДНК (Ogg1, XRCC4, XRCC5, APEX1, POLB, BRCA, RAD51, PARP, ERRC1, ERRC2), про- и антиапоптотических факторов (BCL2, BIRC5, MCL1, BAD, BAK, BAX, BID, Casp3, DIABLO, NDRG, NOXA, PUMA), а также ключевых транскрипционных факторов (p53, NF-κB, NRF2), регулирующих ответ клеток на радиационное поражение. К 24 часам уровни экспрессии большинства исследованных генов нормализовались, однако в клетках A549 сохранялась высокая экспрессия генов апоптоза (BCL2, NOXA, NDRG и PUMA), что коррелирует с их большей радиочувствительностью по сравнению с другими линиями. 4. Получены генно-инженерные конструкции для нокаута генов PRDX1-6, на основе технологии CRISPR/Cas9. Получены клоны клеток A549 с полностью подавленным геном PRDX6 (как по мРНК, так и по белку). Клоногенный тест линии с нокаутом PRDX6 выявил снижение радиорезистентности на ~20%, что свидетельствует о важной роли PRDX6 в обеспечении радиорезистентности клеток A549. Кроме того, получены клоны с подавленными генами PRDX3, PRDX4 и PRDX5. Полученные нокаутные клеточные линии будут использованы для детального исследования на следующем этапе проекта. 5. С помощью нанопорового секвенирования проанализирован транскриптом клеток A549 спустя 4, 24 и 48 ч после облучения (2.5 и 5 Гр). Результаты на 4 и 24 ч коррелируют с результатами, полученными с помощью ПЦР в реальном времени (готовятся к публикации). Получены неожиданные результаты для клеток A549, спустя 48 ч после их облучения. Для дозы 2.5 Гр показано достоверное снижение экспрессии SLC48A1 и APOBEC3C, участвующих в метаболизме нуклеотидов и эпигенетическом ответе. Для дозы 5 Гр наблюдалось снижение экспрессии NUCKS1, RPS16, HSPE1, H4C3, и рост для TMEM147 и CYTB, что связано с нарушением функции митохондрий и рибосом. Эти результаты указывают на более поздние эффекты радиации, связанные с метаболизмом и митохондриальной функцией, и требуют дальнейшего изучения. 6. Разработаны ксенографтные модели с использованием клеток A549, MCF-7 и Caco-2. Определены оптимальные линии иммунодефицитных мышей, способы введения клеток, продолжительность экспериментов с учётом динамики роста опухолей, необходимые условия проведения работ и их общая стоимость.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Пероксиредоксин 6 (PRDX6) является уникальным полифункциональным белком, сочетающим глутатион-зависимую пероксидазную активность и Са²⁺-независимую фосфолипазную активность (aiPLA₂). В отличие от других пероксиредоксинов, Prdx6 способен восстанавливать широкий спектр гидропероксидов, включая фосфолипидные, что делает его ключевым игроком в защите клеточных мембран от окислительного повреждения. Ранее нами было показано, что Prdx6 является наиболее активно экспрессируемой изоформой в ряде раковых клеток человека. Его фосфолипазная активность, активируемая при высоком окислительном стрессе, ассоциирована с пролиферацией, инвазией и метастазированием опухолевых клеток, что указывает на его важнейшую роль в канцерогенезе и устойчивости к лучевой терапии. Целью второго этапа проекта было всестороннее изучение последствий нокаута гена PRDX6 в клеточной линии немелкоклеточного рака легкого человека A549 для оценки его вклада в радиорезистентность и определение основных затронутых молекулярных путей. Основные результаты, полученные в отчетном периоде: 1. Создание и валидация стабильной клеточной линии A549 с биаллельным нокаутом гена PRDX6. С помощью системы CRISPR/Cas9 был получен стабильный клон клеток A549 (линия №6.4.5) с биаллельной делецией в 1-м экзоне гена PRDX6, приводящей к сдвигу рамки считывания и полному отсутствию белка Prdx6. Критически важным было подтверждение отсутствия нецелевых (off-target) мутаций в генах других пероксиредоксинов (PRDX1-5), что обеспечивает чистоту экспериментальной модели для последующих исследований. 2. Установление критической роли PRDX6 в радиорезистентности клеток A549. Клоногенный анализ, золотой стандарт оценки радиочувствительности, продемонстрировал, что нокаут PRDX6 приводит к статистически значимому снижению выживаемости клеток A549 после облучения рентгеновскими лучами в дозах 2.5 и 5 Гр. Радиорезистентность клеток A549(koPRDX6) снизилась на 20-30% по сравнению с клетками дикого типа A549(WT), что прямо указывает на важнейшую радиозащитную функцию Prdx6 при лучевой терапии. 3. Доказательство усиления апоптотического ответа в клетках с нокаутом PRDX6. Комплексный анализ с использованием аннексина V-FITC/PI/DAPI показал увеличение доли апоптотических и некротических клеток в линии A549(koPRDX6) как в нормальных условиях, так и после облучения. Это подтверждается более чем 3-х кратным повышением уровня активной эффекторной каспазы-3. Транскриптомный анализ выявил сдвиг баланса в сторону проапоптотического фенотипа: повышение экспрессии генов-индукторов апоптоза (PUMA, NOXA, BAK, CASP3) и подавление ингибиторов (BCL2, BIRC5) в клетках A549(koPRDX6). 4. Выявление ключевой роли PRDX6 в поддержании миграционно-пролиферативного потенциала. Методом раневой пробы (scratch assay) показано, что нокаут PRDX6 существенно подавляет способность клеток A549 к коллективной миграции и заживлению «раны». Через 12 часов площадь дефекта в культуре A549(WT) сократилась на ~50%, а в культуре A549(koPRDX6) – лишь на 25-30%. Это свидетельствует о критической роли Prdx6 в процессах, лежащих в основе инвазии и метастазирования. 5. Комплексная характеристика изменений антиоксидантной системы и окислительного стресса. Нокаут PRDX6 запускает мощные компенсаторные механизмы, которые включают в себя гиперэкспрессию других изоформ пероксиредоксинов (уровень мРНК PRDX2 повышен >10 раз, PRDX1 ~3 раза), гиперактивацию сигнального пути NRF2 (уровень мРНК гена NFE2L2 повышен в 2 раза, а белка NRF2 – в 3 раза). Ответ на облучение в нокаутных клетках A549(koPRDX6) сильнее и наступает раньше. При этом, несмотря на адаптивную индукцию других изоформ пероксиредоксинов, функция Prdx6 не может быть компенсирована. Исследование редокс-статуса клеток, с использованием флуоресцентного зонда carboxy-H₂DCFDA, показало достоверное повышение (на 10-15%) уровня внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) в клетках A549(koPRDX6) после облучения. 6. Доказательство гиперактивации систем репарации ДНК и повышенного уровня ее повреждений. В условиях нокаута PRDX6 наблюдается повышенный базальный уровень мРНК генов ключевых путей репарации ДНК (BER, NER, HR) и их основных регуляторов (TP53, NF-κB). Показан более выраженный (на 50-100% выше, чем в WT) транскрипционный ответ этих генов на облучение, особенно в ранние сроки. Обнаружен повышенный (в 2-3 раза) уровень фосфорилированного гистона γH2AX – маркера двунитевых разрывов ДНК, что указывает на хроническое окислительное повреждение ДНК в отсутствие Prdx6. 7. Анализ транскриптома клеток A549(koPRDX6) подтвердил основные тенденции, выявленные методом ПЦР-РВ: компенсаторную гиперэкспрессию PRDX2, активацию проапоптотических генов и генов репарации ДНК. Полный биоинформатический анализ находится в завершающей стадии. Таким образом, проведенное исследование показало, что Prdx6 является «центральным узлом», интегрирующим антиоксидантную защиту, репарацию ДНК, контроль апоптоза и миграционно-пролиферативный потенциал в клетках немелкоклеточного рака легкого А549. Утрата Prdx6 делает опухолевые клетки значительно более уязвимыми к окислительному стрессу и радиационному воздействию, смещая баланс в сторону гибели. Полученные результаты доказывают, что Prdx6 служит важнейшим фактором радиорезистентности и перспективной терапевтической мишенью для повышения эффективности лучевой терапии рака.