Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Предложенный способ получения фикобилипротеинов (ФБП) базируется на использовании культур красной микроводоросли P. purpureum и цианобактерии A. platensis. Показано, что наиболее благоприятные условия для накопления пигментов при промышленном культивировании следующие: температура 18-28 ºС, естественная освещенность культиваторов (в случае P. purpureum притенение в периоды максимальной солнечной активности), дополнительное введение CO2 (для P. purpureum), непрерывное перемешивание культуры. Для сбора клеток микроводоросли P. purpureum использовали метод отстаивания в течение 2-х ч. У A. platensis отделение и промывку биомассы от среды проводили на ситах. Показано, что замораживание не влияет на содержание ФБП в получаемой биомассе. При высушивании биомассы продуцентов в сушильном шкафу или сублимационной сушке показано преимущество второго варианта. Экспериментально показано, что при отборе биомассы P. purpureum на линейной стадии роста накопительной культуры или при выращивании в квазинепрерывном режиме, достаточно 6 циклов замораживания-оттаивания для извлечения большей части фикоэритрина (85 %). При проведении экстракции из сухой биомассы, увеличение числа циклов замораживание-оттаивание до 12 незначительно влияет на степень экстракции пигмента. Установлено, что режим измельчения биомассы влияет на процесс экстракции. Измельчение биомассы на обычной механической мельнице в противовес применению ультрамельницы позволило максимизировать выход пигмента из сухой биомассы. Изучена динамика изменений концентрации экстрактов ФБП с применением различных режимов хранения и добавления стабилизаторов. В качестве контроля использовали полученный водный экстракт без добавок, в опытных вариантах использовали этиловый спирт (20%), хлорид натрия (2%) и лимонную кислоту (0.1%) для стабилизации экстрактов. Хранение экстрактов осуществляли в следующих условиях: в темноте при температуре 5 °С; в темноте при температуре от 18 до 20 °С; при естественной освещенности и температуре 18-20 °С. Хранение экстрактов ФБП в этих условиях проводили на протяжении 2 месяцев, контроль концентраций пигментов осуществляли оптическим методом. При хранении водных растворов ФБП, концентрация пигмента снижалась у всех вариантов эксперимента. Добавление любого стабилизатора в эксперименте приводило к снижению скорости деструкции пигментов по сравнению с контрольным вариантом при всех режимах хранения. Хранение водных растворов пигментов с добавлением стабилизаторов (в темноте, на холоде) превышало 40 суток. Более короткий период хранения отмечен при добавлении лимонной кислоты. Наиболее неблагоприятными условиями, при которых отмечена наиболее высокая скорость деградации пигментов в растворах, является комбинация освещенности и повышенной температуры. Острая токсичность экстракта в отношении взрослых устриц оценивалась в двух блоках экспериментов: для иммунных клеток устриц (гемоцитов) в условиях in vitro, а также анализ ответа организма (работы in vivo). Был исследован диапазон концентраций экстракта 2-200 мкг/мл (2 мкг/мл; 20 мкг/мл и 200 мкг/мл), а также отдельно проведен тест выживаемости устриц при концентрации экстракта в воде 800 мкг/мл. При данной концентрации экстракта наступала гибель 90% устриц в течение первых 24 ч, потому в дальнейшем эта концентрация была исключена из плана работ. Острую токсичность оценивали на взрослых трёхлетних особях устриц Magallana gigas. В экспериментах in vitro использовали суспензии гемоцитов в стерильной морской воде с добавлением различных концентраций экстракта ФБП. Клетки инкубировали в течение 1 часа или 3 часов, после чего определяли следующие параметры: процент мертвых гемоцитов в суспензии, функциональную активность гемоцитов, повреждение ДНК клеток и апоптоз гемоцитов. Установлено, что инкубация гемоцитов с разными концентрациями экстракта ФБП в течение 1–3 часов не вызывала увеличения количества погибших клеток в суспензиях и не стимулировала апоптоз. Кроме того, не было обнаружено снижения функциональной активности гемоцитов. Тем не менее, показано, что экстракт в концентрации 200 мкг/мл индуцирует статистически значимое повышение числа разрывов ДНК в гемоцитах уже через 1 час инкубации. Для оценки острой токсичности в условиях in vivo, устрицы были случайным образом распределены по четырём группам: контрольная группа и три опытные группы с добавлением водного экстракта ФБП в концентрациях 2, 20 и 200 мкг/мл соответственно. Устрицы содержались в этих условиях в течение 24 и 48 ч, после чего проводились измерения следующих параметров: процент мертвых и апоптотических гемоцитов, их функциональная активность, повреждение ДНК клеток, клеточный состав гемолимфы, респираторная активность устриц и экспрессия белков теплового шока (hsp70 и hsp90) в жабрах. Выживаемость устриц во время теста острой токсичности составляла 100% на всём исследованном диапазоне концентраций. Респираторная активность устриц оставалась неизменной под воздействием экстракта ФБП, за исключением единичного повышения этого параметра в опытной группе с концентрацией 2 мкг/мл через 24 часа. Не было замечено изменений в клеточном составе гемолимфы устриц, а также в доле мертвых и апоптотических клеток в гемолимфе. Однако высокая концентрация экстракта (200 мкг/мл) снижала функциональную активность гемоцитов как через 24, так и через 48 часов воздействия. Снижение функциональной активности клеток также наблюдалось при концентрации 20 мкг/мл через 48 часов. Как и в экспериментах in vitro, было отмечено увеличение числа разрывов ДНК в гемоцитах при концентрации экстракта 200 мкг/мл через 24 и 48 часов. Экстракт ФБП в исследованных концентрациях не оказывал влияния на экспрессию белка hsp70, но уровень экспрессии hsp90 значительно увеличивался при кратковременном воздействии высокой концентрации экстракта (200 мкг/мл). При длительной экспозиции устриц с экстрактом (48 часов), наблюдалось значительное увеличение уровня hsp90 на всех исследуемых концентрациях, причём это увеличение имело дозозависимый характер. Комплексный анализ данных, полученных в условиях in vivo и in vitro, указывает на вероятность интоксикации устриц на клеточном и организменном уровнях при концентрации экстракта 200 мкг/мл. Несмотря на это, содержание устриц в среде с этой концентрацией экстракта не вызывает их гибель и не влияет на респираторную активность, что говорит о сравнительно низкой токсичности данного добавки. Признаки повреждения гемоцитов и снижение их функциональной активности, выявленные в краткосрочных экспериментах, делают использование концентрации 200 мкг/мл неприемлемым на последующих стадиях исследования. Диапазон концентраций от 2 до 20 мкг/мл считается безопасным для организма устриц.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В течение второго этапа реализации проекта были проведены работы по разработке метода экспресс контроля содержания фикобилипротеинов в биомассе низших фототрофов. Экспериментально разработан и валидирован метод экспресс-оценки сухой биомассы микроводорослей на основе оптической плотности, который позволяет без трудоемкой пробоподготовки, с использованием стандартного фотометра, оперативно оценивать концентрацию сухого вещества непосредственно в нативной культуре. Для двух видов микроводорослей-продуцентов, Porphyridium purpureum и Arthrospira platensis, установлены линейные зависимости между оптической плотностью при длине волны 750 нм и концентрацией сухого вещества. Кроме того, созданы видоспецифичные алгоритмы для быстрого определения содержания ключевых пигментов: для P. purpureum подтверждена применимость стандартных коэффициентов экстинкции, а для A. platensis показана необходимость использования скорректированных «нативных» коэффициентов (65 л·г⁻¹·см⁻¹ для хлорофилла *a* и 5.6 л·г⁻¹·см⁻¹ для C-фикоцианина), так как стандартные приводят к занижению результатов. Разработан упрощенный алгоритм расчета через разность оптических плотностей на специфичных длинах волн, что делает метод доступным для технологических служб при промышленном выращивании микроводорослей. Также в ходе реализации проекта экспериментально доказано, что водный экстракт фикобилипротеинов обладает выраженным иммуномодулирующим действием на организм гигантской устрицы (Magallana gigas). Установлено, что экстракт положительно влияет на параметры врожденного иммунитета и интенсивность аэробного обмена иммунных клеток - гемоцитов как при непосредственном воздействии in vitro, так и при поступлении экстракта в организм путем фильтрации (эксперименты in vivo). Наиболее эффективная концентрация экстракта (80 мкг/мл) достоверно усиливает фагоцитарную активность гемоцитов в первые 24 часа, повышает активность лизосом и стимулирует митохондриальное дыхание гемоцитов, обеспечивая энергетическую базу для иммунных реакций устриц. Одновременно экстракт повышает антиоксидантную защиту клеток гемолимфы за счет снижения образования в них активных форм кислорода и модулирует гуморальный иммунитет, усиливая экспрессию ключевых регуляторных белков — интерлейкина-17 и фактора некроза опухоли в течение первых 24-48 ч воздействия. Показано, что более низкие концентрации экстракта фикобилипротеинов (2-20 мкг/мл) проявляют умеренный и отсроченный иммуностимулирующий эффект, активируя исследованные показатели, как правило, с 48 часов, что указывает на адаптивный характер реакции и потенциальную пригодность таких доз для длительной профилактической поддержки иммунитета устриц в питомниках. Сравнение экспериментов in vitro и in vivo подтверждает, что трофический путь поступления экстракта через фильтрацию воды обеспечивает высокий уровень стимуляции иммунной системы, сохраняя эффекты, наблюдаемые при прямом воздействии на клетки. Таким образом, результаты настоящего этапа проекта свидетельствуют о тои, что включение экстракта фикобилипротеинов в состав кормов для маточного стада гигантских устриц в питомниках представляется эффективной стратегией для повышения врожденного иммунитета моллюсков за счет комплексного положительного воздействия на функциональную активность их иммунных клеток - гемоцитов. Результаты второго этапа реализации проекта были представлены на VIII Международной верещагинской байкальской конференции на базе Лимнологического института СО РАН (г. Иркутск), где был представлен устный доклад на Семинаре и круглом столе «Инновации в сфере ихтиологии: Искусственное воспроизводство, проблемы аквакультуры». Также результаты проекта были доложены на XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием для молодых учёных «Понт Эвксинский-2025» (г. Севастополь) в рамках работы секции «Водные биологические ресурсы, биотехнология и аквакультура». Помимо этого, по теме проекта был успешно защищен магистерский диплом (Парфенов В.В. Тема: "Острая токсичность экстракта фикобилипротеинов как потенциальной кормовой добавки для гигантской устрицы Magallana gigas"). Севастопольский государственный университет, Направление подготовки (специальность) 05.04.06 Экология и природопользование, Профиль (специализация) Гидробиология и общая экология, Кафедра "Устойчивое развитие и управление природными ресурсами" Для освещения результатов проекта вне академической аудитории и ознакомления с выявленными полезными свойствами экстракта фикобилипротеинов возможных заинтересованных лиц были даны несколько интервью федеральным и региональным новостным агенствам: https://vk.com/wall-178389463_4223 https://vesti92.ru/2025/11/13/sevastopolskie-uchenye-razrabotali-sposob-povyshenija-immuniteta-molljuskov.html https://iz.ru/1962126/denis-gricenko/estestvennoe-v-nauke-vodorosli-dla-zdorova-ustric-i-plasticnyi-led https://t.me/ibss_ras/3432 https://www.rscf.ru/news/agriculture/uchenye-rf-nashli-sposob-usilit-immunitet-ustrits-dlya-otechestvennykh-pitomnikov/ https://nauka.tass.ru/nauka/25154631