Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проведен анализ возможности передачи флюоресцентной метки от MV к бактериям группы ESKAPE, на примере K. pneumoniae и S. aureus. Установлено, что после совместного культивирования в присутствии CFSE микровезикул и у K. pneumoniae, и у S. aureus флуоресценция по FITC (необходим для детекции CFSE) увеличивается относительно негативных контролей – неокрашенных бактерий и бактерий, прокультивированных с интактными микровезикулами. Полученные данные свидетельствуют в пользу передачи меченного CFSE белка, входившего в состав MV, в бактериальные клетки. Изучен фенотип клеток NK-92 на наличие рецепторов врожденного иммунитета, TLR1, TLR2, TRL4, TLR5, TLR6. Впервые установлено, что клетки NK-92 экспрессируют TLR2 и TLR5. Установлено, что индуктор клеточного стресса PMA способен усиливать экспрессию TRL5 клетками NK-92. Таким образом, естественные киллеры потенциально способны воспринимать сигналы от патоген-ассоциированных молекулярных паттернов. Получены изображения взаимодействия K. pneumoniae и клеток NK-92 в светлом поле и при помощи конфокальной микроскопии, создана 3D модель их взаимодействия. Установлено, что клетки NK-92 способны эффективно подавлять образование и рост колоний некоторых бактерий группы ESKAPE: S. aureus, K. pneumoniae, A. baumanii, Enterobacter spp). Микровезикулы клеток NK-92 оказали ингибирующий эффект на образование и рост колоний грамположительных бактерий S. aureus. Супернатанты бактерий группы ESKAPE оказывают влияние на жизнеспособность клеток линии NK-92. Для дальнейших экспериментов выбрали дозы, которые не вызывали изменение числа живых клеток NK-92 по данным экспериментов с PI – краситель отражает число клеток с поврежденной мембраной. Установлено, что при совместном культивировании в течение 4 часов супернатант S. aureus, снижал количество жизнеспособных клеток, а также повышал количество клеток NK-92 в состоянии некроза. При длительном культивировании клеток NK-92 в присутствии супернатантов бактерий K. pneumoniae и Enterobacter spp. наблюдается снижение количества жизнеспособных клеток. Также эффекторные клетки, прокультивированные в присутствии супернатанта Enterobacter spp. обнаруживаются в пуле клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза. При культивировании клеток NK-92 в присутствии супернатанта E. faecium и K. pneumoniae возрастает число клеток, подвергшихся позднему апоптозу. Данные, полученные нами после окрашивания PI и смесью YoPro/PI не противоречат друг другу, так как краситель YoPro связывается с клетками на стадии раннего апоптоза, который может не доходить до конца, оставляя клетку жизнеспособной. Для дальнейшего изучения феномена необходимо провести анализ пролиферации клеток NK-92 после взаимодействия с бактериальными супернатантами, изучить активность каспаз в клетках NK-92. Установлено, что культивированиtе клеток NK-92 с супернатантом K. pneumoniae приводило к снижению относительного содержания мРНК IL-10, но не приводило к изменению относительного содержания мРНК IFNγ или RANTES. Другие супернатанты не оказывали влияния на относительное содержание мРНК IL-10, IFNγ, RANTES. Установлено, что предварительное культивирование клеток NK-92 в присутствии супернатантов не приводило к изменению относительного количества мРНК рецепторов NKG2C, NKG2A, NKp30. Разработаны две дополнительные модели, описывающие свойства NK-клеток и их MV. Эти модели планируется дополнительно использовать для оценки свойств супернатантов бактерий. Установлен факт передачи флуоресцентной метки от MV естественных киллеров клеткам THP-1. Установлено. что MV интактных естественных киллеров снижают фагоцитарную активность клеток THP-1 и интенсивность окислительного взрыва, снижают экспрессию CD206. Установлено усиление экспрессии клетками THP-1 CD54, CD71, CD206 по сравнению со спонтанным уровнем, появление CD284, а также усиление фагоцитоза и интенсивности окислительного взрыва после совместной культивации клеток с MV активированных TNFα NK-клеток. Таким образом, установлена способность MV интактных или активированных естественных киллеров по-разному модулировать фенотип и функции моноцитов. Полученные результаты доказывают способность MV выступать в роли дополнительного механизма реализации иммуномодулирующих функций естественных киллеров в отношении моноцитов. Указанную модель взаимодействия MV клеток NK-92 с моноцитами\макрофагами можно в дальнейшем использовать для оценки влияния супернатантов бактерий на функции естественных киллеров и их MV. Установлено, что цитокины изменяют экспрессию рецепторов апоптоза NK-клетками: в присутствии TNFα количество и интенсивность экспрессии Fas увеличивались, а в присутствии TGFβ количество и интенсивность экспрессии рецептора DR5 уменьшались. Растворимые факторы хориона изменяют экспрессию TRAIL и FasL клетками NK-92, что может отражать подавление TRAIL-зависимого механизма апоптоза в первом триместре и стимуляцию Fas-зависимого механизма в третьем триместре. В присутствии трофобласта экспрессия TRAIL и DcR1 NK-клетками снижалась по сравнению с неповреждёнными клетками, что указывает на ингибирующее воздействие трофобласта на цитотоксичность NK-клеток. В присутствии CM хориона и трофобласта было обнаружено меньшее количество NK-92-клеток, экспрессирующих DR4 и DR5. Таким образом, растворимые факторы, выделяемые клетками хориона, регулируют устойчивость NK-клеток к гибели, связывая TRAIL и, вероятно, поддерживая их активность на определённом уровне при контакте с трофобластом. Указанную модель взаимодействия MV клеток NK-92 с трофобласта можно в дальнейшем использовать для оценки влияния супернатантов бактерий на функции естественных киллеров и их MV. С целью поиска новых возможных приложений воздействия микровезикул естественных киллеров и супернатантов бактерий группы ESKAPE были написаны два обзора по ангиогенезу. Собранная информация может стать заделом для расширения изучения роли микровезикул естественных киллеров и бактериальных супернатантов в новых моделях, включающих изучение функции эндотелиальных клеток и реализации ангиогенеза под контролем бактерий и естественных киллеров.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В течение отчетного периода продолжалась работа по оценке взаимных эффектов NK-клеток и бактерий группы ESKAPE. Впервые с помощью комбинированного подхода проанализирован состав супернатанта представителя группы - Enterobacter spp., и определены общие маркеры его метаболитного профиля. В дальнейшем это позволит перейти к определению потенциальных регуляторов функций клеток иммунной системы. Кроме того, получены результаты, позволяющие расширить представления о регуляции фенотипических и секреторных характеристик естественных киллеров бактериями: с помощью проточной цитометрии не установлено влияние на секрецию цитокинов IL-10, IFNγ и RANTES или экспрессию маркеров NK-клеток NKG2C, NKG2A, NKp30, но отмечено повышение интенсивности экспрессии клетками линии NK-92 основного фенотипического маркера CD56, также ассоциированного с дифференцировкой естественных киллеров. Впервые был проанализирован фенотип больших внеклеточных везикул на предмет экспрессии TLR2 и TLR5. Несмотря на то, что ранее нами была показана экспрессия данных молекул клетками-источниками, на LEVs не удалось обнаружить экспрессию данных молекул. Однако нами был установлен бактериостатический эффект как естественных киллеров, так и их везикул. Кроме того, впервые показан эффект везикул в отношении чувствительности S.aureus к антибактериальным препаратам: это выражалось в увеличении зоны ингибирования колоний клиндамицином, эритромицином, норфлоксацином и цефокситином после взаимодействия с LEVs и снижении минимальной ингибирующей концентрации клиндамицина в тех же условиях. Данные результаты могут быть связаны с наличием в секреторном профиле NK-клеток и их везикул дефензинов. В отчетном периоде с помощью иммуноферментного анализа установлено, что клетки линии NK-92 спонтанно секретируют дефензин-α1, кроме того, секреция белка может быть индуцирована цитокинами (TNFα или IFNγ) и бактериальным LPS. Кроме того, впервые обнаружено содержание оценили содержание белка в LEVs, полученных в результате культивирования клеток линии NK-92 в различных условиях. Поскольку в прошлом году нами отмечен эффект супернатантов в отношении взаимодействия NK-клеток с клетками трофобласта, в этом году было принято решение проанализировать с применением различных методов влияние других индукторов на эту систему с целью расширения возможностей изучения эффектов бактерий группы ESKAPE на систему мать-плод. Установлено, что клетки трофобласта линии JEG-3 и NK-клетки линии NK-92 экспрессируют стрессовые молекулы MIC. NK-клетки также на высоком уровне экспрессируют рецептор NKG2D. Обработка клеток трофобласта TSA вызывала снижение экспрессии ими молекул MIC, что также сопровождалось высвобождением растворимой формы MICB. Тем не менее, снижение экспрессии трофобластом молекул MIC под действием TSA не избавляло их от цитотоксического действия NK-клеток. Лишь после активации NK-клеток IL-12 было обнаружено снижение восприимчивости трофобласта, обработанного TSA, к цитотоксическому действию NK-клеток. Таким образом, NK-клетки, активированные IL-12, теряют способность эффективно убивать клетки трофобласта, обработанные TSA, через механизм, который задействует молекулы MIC. Проекту посвящена публикация в СМИ: https://www.forbes.ru/special/molodaya_nauka/?erid=F7NfYUJCUneTTTrUXXoH https://www.forbes.ru/special/molodaya_nauka/polina-grebenkina/?&erid=F7NfYUJCUneTTTrUXXoH