Аннотация результатов, полученных в 2024 году
За первый год работы по гранту был проведён скрининг белков и пептидов, взаимодействующих с TNF alpha и его рецепторами, а также был проведён анализ агрегации и взаимодействия функционального амилоида FXR1 с белками стресс-гранул в нейрональных клетках при различных типах стрессовых воздействий. Согласно нашей рабочей гипотезе взаимодействие TNF alpha с рецепторами TNF-R1 или TNF-R2 может зависеть от пептидного гормона, который выступает в роли кофактора. Связывание с этим пептидным гормоном определяет взаимодействие TNF alpha с первым или вторым рецептором и, соответственно, гибель клеток или цитопротекторный эффект. Мы провели скрининги растворимых белков мозга крысы с рекомбинантными белками TNF alpha, TNF-R1 и TNF-R2. В результате проведённых скринингов был выявлен ряд белков, которые связываются с рекомбинантными белками TNF alpha, TNF-R1 и TNF-R2. С учётом литературных данных были составлены списки наиболее перспективных кандитатов. В списки вошли в основном межклеточные белки и белки выявленные во всех трёх скрингах идентифицированные масс-спектрометрией с наибольшим счётом. Белки, которые были идентифицированы и в опыте и в отрицательном контроле были исключены из дальнейшего анализа. В соответствии с описанными критериями мы выявили шесть белков, которые могут взаимодействовать с TNF alpha. Также в скринингах были выявлены белки, которые могут связываться с TNF-R1 и TNF-R2 (36 и 30 белков, соответственно). Следует учитывать, что данные, полученные на первом этапе работы, представляют собой результаты масштабного протеомного скрининга. Конформация рекомбининтных белков TNF alpha, TNF-R1 и TNF-R2 может отличаться от их конформации in vivo. Кроме того, в скрининге могут выявляться белки и пептиды, которые взаимодействуют не только с целевыми белками, но образуют комплексы с их партнёрами. На данном этапе исследования нельзя сделать окончательное заключение, что выявленные белки действительно физически взаимодействуют с TNF alpha и (или) его рецепторами in vivo. Проведённые скрининги позволили выявить перспективные белки, эффекты которых ещё предстоит оценить. В качестве наиболее перспективных кандидатов, цитопротекторные эффекты которых планируется оценить в дальнейших исследованиях, мы выделили следующие белки и пептиды: - Гормональный пептид Insulin-like growth factor II (IGF-2). Выявлен в скрининге с TNF alpha. Преодолевает гематоэнцефалический барьер, Уровень продукции IGF-2 понижен при различных нейровоспалительных заболеваниях. На фоне нейродегенеративных заболеваний его введение улучшает когнитивные показатели. - Macrophage migration inhibitory factor. Выявлен в скрининге с TNF-R1. Механизм нейропротекции этого фактора неизвестен, он способствует восстановлению тканей мозга после нейропатологий. - Annexin A2. Выявлен во всех трёх скринингах (с TNF alpha, TNF-R1 и TNF-R2). Дефицит этого белка усиливает воспаление у мышей после черепномозговой травмы. - Protein S100-B. Выявлен в скрининге с TNF-R1. Нейропротектор, снижает продукцию TNFalpha. Возможные цитопротекторные свойства этих белков планируется оценить на втором этапе работы по гранту. Другое направление нашей работы было посвящено оценке способности РНК-связывающего белка FXR1 формировать крупные цитоплазматические гранулы при разных типах стрессовых воздействий – обработке клеток метаарсенитом, тепловом шоке и голодании. Мы показали, что белок FXR1 формирует цитоплазматические гранулы при тепловом шоке и воздействии метаарсенита. При голодании по сыворотке и при обработке клеток TNF alpha FXR1-содержащие гранулы не образуются. Отметим, что классические TIA-1 –содержащие стресс-гранулы как известно также формируются при тепловом шоке и воздействии метаарсенита, но не при обработке клеток TNF alpha или голодании. Далее мы оценили колокализацию FXR1 в норме и при стрессовых воздействиях с коровыми белками стресс гранул TIA-1 и FMRP. При воздействии метаарсенитом и при тепловом шоке FXR1 чётко колокализуется с белками TIA-1 и FMRP. Маркёрный белок стресс гранул TIA-1 в норме локализующийся в ядре, при стрессовых воздействиях частично релоцируется в цитоплазму, где формирует гранулы, колокализующиеся с FXR1. На основании полученных результатов можно заключить, что FXR1 при определённых стрессовых воздействиях включается в состав нейрональных стресс-гранул. Ранее мы показали, что FXR1 в амилоидной форме в норме связывает молекулы РНК в нейронах головного мозга крысы и других челюстных позвоночных. Мелкие амилоидные частицы FXR1 связывают молекулы РНК в нейронах головного мозга и предохраняют их от деградации. Оставался открытым вопрос – сохраняет ли FXR1 при стрессовых воздействиях в составе крупных цитоплазматических гранул амилоидную конформацию? Для того, чтобы ответить на этот вопрос мы оценили колокализацию FXR1 с амилоидспецифичными антителами ОС (ThermoFisher Scientific, USA) при индукции клеточного стресса метаарсенитом. Результаты иммуноцитохимических исследований показали, что гранулы FXR1 после воздействия метаарсенита чётко колокализуются в клетках нейробластомы с амилоидспецифичными антителами ОС. Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что FXR1 входит в состав нейрональных стресс гранул в амилоидной форме. Стресс гранулы являются динамическими структурами, которые могут быстро собираться и разбираться при изменении условий. По всей вероятности, мелкие амилоидные частицы FXR1 объединяются с другими белками стресс гранул не за счёт формирования кросс-бета структур, а за счёт формирования слабых ионных связей, что не препятствует разборке гранул при прекращении стрессовых воздействий. По результатам первого года работы опубликована одна статья в журнале первого квартиля: Valina, A.A.; Siniukova, V.A.; Belashova, T.A.; Kanapin, A.A.; Samsonova, A.A.; Masharsky, A.E.; Lykholay, A.N.; Galkina, S.A.; Zadorsky, S.P.; Galkin, A.P. Amyloid Fibrils of the s36 Protein Modulate the Morphogenesis of Drosophila melanogaster Eggshell. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 12499. https://doi.org/10.3390/ijms252312499. Также результаты представлены в трёх докладах на VIII Съезде ВОГиС и трёх постерных сообщениях на российских конференециях.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Представленный проект посвящён поиску прототипов лекарственных средств, регулирующих нейрональный стресс-ответ, и анализу роли функциональных амилоидов головного мозга в норме и при патологии. Ранее, с помощью протеомного скрининга мы выявили межклеточные белки и пептиды головного мозга крысы, которые связывались с ключевым провоспалительным цитокином TNF alpha. В 2025-м году мы оценили возможные цитопротекторные эффекты этих полипептидов при инкубации культуры клеток с TNF alpha. Добавление каждого из исследуемых полипептидов не влияло на рост культуры клеток L929 в отсутствии TNF alpha. При добавлении 40 нг/мл TNF alpha все полипептиды, используемые в эквимолярной концентрации по отношению к TNF alpha, демонстрируют достоверный цитопротекторный эффект (p ≤ 0.0001 или p ≤ 0.001). Этот результат настораживает по двум причинам. Во первых, сложно представить, что все исследуемые полипептиды являются специфическими ингибиторами TNF alpha. Во вторых, цитопротекторные эффекты были не полными и сходными между собой по значению. Теоретически можно предположить, что в некоторых случаях наблюдаемые эффекты – следствие неспецифических белок-белковых взаимодействий. Вместе с тем, сомнительно, что пептиды длиной 4 и 8 аминокислотных остатков (НАЕЕ и CCK-8, соответственно) неспецифично связываются с TNF alpha, блокируя его цитотоксический эффект. Вполне вероятно, что для более выраженного цитопротекторного эффекта некоторых из исследуемых белков / пептидов нужно брать их не в эквимолярной концентрации по отношению к TNF alpha, а в большей концентрации. Так, соотношение концентраций в плазме крови TNF alpha к CCK-8 примерно 1:50, а к Ac-HAEE-NH2 - 1:1000. Специфичность взаимодействия исследуемых полипептидов с TNF alpha будет изучена на следующем этапе работы. Формирование стресс-гранул опосредовано индукцией киназного каскада и помогает клеткам пережить стресс. Однако при хронических воспалениях стресс-гранулы не разбираются, и связанное с их образованием репрограммирование трансляции приводит к апоптозу. В связи с этим мы решили оценить возможное влияние исследуемых нами белков / пептидов на сборку стресс-гранул. Эффект исследуемых полипептидов (IGF-2, MIF, Annexin A2, Protein S100-B, CCK-58, CCK-8, Ac-HAEE-NH2 и и Neuropeptide Y) на формирование стресс-гранул под воздействием метаарсенита натрия оценивали в соответствии со стандартной методикой. Стресс гранулы в данном случае рассматриваются в качестве маркёра стресс-индуцированного киназного каскада. Метаарсенит вызывал индукцию стресс-гранул, но добавление исследуемых полипептидов не влияло на частоты их формирования. Вероятно, белки и пептиды мозга, используемые в работе, не вовлечены в регуляцию киназного каскада, индуцирующего формирование стресс-гранул при стрессовых воздействиях. Другое направление нашей работы было посвящено идентификации нового функционального амилоида в головном мозге позвоночных. С помощью протеомного скрининга мы показали, что белок МВР (Myelin Basic Protein) выявляется в головном мозге во фракции детергент-устойчивых амилоидоподобных олигомеров и агрегатов. Этот белок локализуется в отростках олигодендроцитов, которые формируют миелиновые оболочки активно работающих нейронов. Он играет основную роль в компактизации миелина, что способствует защите нейронов и эффективному проведению нервных импульсов. Мы оценили амилоидные свойства МВР in vivo, ex vivo и in vitro. Для оценки амилоидных свойств белка MBP был проведён анализ колокализации этого белка на криосрезах головного мозга лягушки R. temporaria, черепахи T. scripta, курицы G. gallus domesticus и крысы R. norvegicus с амилоидспецифичными красителями тиофлавин S и Конго красный. Антитела специфически окрашивают пучки миелиновых волокон на криосрезах мозга всех исследуемых объектов. Сигнал к белку МВР колокализуется с амилоидспецифичным красителем тиофлавин S. При совмещении полученных изображений наблюдается совпадение сигналов. Аналогичным образом была проанализирована колокализация белка MBP с амилоидспецифичным красителем Конго красным. У всех исследуемых представителей различных групп позвоночных животных в миелиновых волокнах наблюдается колокализация сигнала к белку МВР с Конго красным. Чтобы получить убедительные доказательства амилоидной природы MBP, мы оценили амилоидные свойства этого белка, выделенного из мозга крысы методом иммунопреципитации с использованием коммерчески доступных антител к MBP. Для выделения очищенных фибрилл MBP мы использовали собственный метод выделения амилоидных фибрилл из любых биологических объектов. MBP, выделенный из мозга, связывается с Конго красным и демонстрирует яблочно-зелёное свечение в поляризованном свете. Более того, трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) в сочетании с методом иммуноголд подтвердила, что выделенные фибриллы содержат MBP. Эти данные убедительно свидетельствуют об амилоидной природе белка MBP. С помощью биоинформатического подхода AmylPred2 было обнаружено присутствие амилоидогенного мотива PVVHFFKNI во всех изоформах MBP крысы. Более того, сравнительный анализ во всех изоформах MBP у различных представителей челюстных позвоночных выявил консенсусную последовательность VVHFF. Однако, данные, полученные с помощью биоинформатических алгоритмов, требуют экспериментальной проверки. Мы сконструировали плазмиды для продукции различных фрагментов MBP, слитых с желтым флуоресцентным белком YFP. Проведённый анализ показал, что для агрегации МВР необходим центральный фрагмент с 60-й по 119-ю аминокислоту. Мы также показали, что фрагмент МВР(60-119) формирует фибриллы in vitro в физиологических условиях. В целом, мы показали, что белок MBP образует амилоидные фибриллы in vitro, in vivo и ex vivo. Амилоидные фибриллы MBP, очевидно, являются идеальным природным материалом для компактизации миелина и изоляции аксонов, способствуя эффективному проведению нервных импульсов. На основании полученных данных представлена модель, отражающую роль MBP в формировании миелиновых оболочек. Согласно этой модели, MBP не только связывает противоположные мембраны отростков олигодендроцитов, но и обеспечивает продольную амилоидную сшивку миелиновых оболочек (Sysoev et al., 2025, https://www.nature.com/articles/s41598-025-13524-z). По результатам второго года работы по гранту опубликована три статьи, две из них в журналах первого квартиля (Sysoev et al., 2025, https://www.nature.com/articles/s41598-025-13524-z; Galkin et al., 2025, https://www.mdpi.com/1422-0067/26/21/10459; Valina et al., 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12118398/). Результаты представлены в приглашённом докладе на международной конференции «Functional amyloids» (Гамбург, Германия), а также в стендовом докладе на той же конференции.