Новые модели нейродегенеративных заболеваний и перспективные генотерапевтические препараты

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-75-30023

НазваниеНовые модели нейродегенеративных заболеваний и перспективные генотерапевтические препараты

Руководитель Белоусов Всеволод Вадимович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации , г Москва

Конкурс №81 - Конкурс 2023 года по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые слова Нейродегенеративные заболевания, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, ишемический инсульт, атаксии, ферроптоз, перекисное окисление липидов, хемогенетика, окислительный стресс, биосенсоры, генная терапия, аденоассоциированные вирусы, GPX4, FSP1

Код ГРНТИ34.15.43

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Окислительный стресс сопровождает огромное количество разных по своей природе патологий. В их числе инсульт и нейродегенеративные заболевания. Эта связь не удивительна, т.к. кислород является центральной молекулой аэробного метаболизма, а его активные формы (АФК) способны вызывать повреждения липидов, белков, нуклеиновых кислот. Несмотря на тысячи научных публикаций по данной проблематике, основной вопрос остается: является ли окислительный стресс драйвером патологии или ее вторичным проявлением, когда в ходе развития патологии нарушаются все процессы, включая кислородный метаболизм? Центральной концепцией данного исследования является метаболическая уязвимость нейронов, обусловленная тремя факторами. Во-первых, нейроны чрезвычайно метаболически нагружены, потребляя значительное количество энергии для поддержания мембранного потенциала, создания ионных градиентов, синтеза и обратного захвата нейротрансмиттеров. Окислительное фосфорилирование – главный источник энергии, поэтому в метаболически активных нейронах неизбежно происходит генерация АФК. Во-вторых, синаптические компартменты нейронов имеют высоко флюидные мембраны. Это связано с необходимостью постоянно поддерживать процессы слияния и отшнуровки везикул и синаптической мембраны для выброса и обратного захвата нейромедиатора, а также для постоянного ремоделирования мембран в процессах нейрональной пластичности. Для поддержания флюидности мембраны нейронов содержат высокие концентрации полиненасыщенных жирных кислот и подвержены перекисному окислению. Оно приводит к дисфункции мембраны и остановке всех нормальных процессов, протекающих в ней. В-третьих, нейроны являются экстремально поляризованными клетками, в которых затруднен транспорт между телом клетки и удаленными аксональными и дендритными структурами. Это означает логистические проблемы в репарации окислительных повреждений. Эти три фактора обуславливают принципиальную уязвимость нейронов и могут являться триггером множества нейродегенераций. Предлагаемый проект является масштабным междисциплинарным исследованием, которое впервые позволит установить причинно-следственные связи между патологиями мозга и окислительным стрессом, создать принципиально новые модели нейродегенеративных заболеваний на животных, и разработать новые методы лечения, основанные на глубинном понимании причинно-следственных связей между локальным окислительным стрессом и нейродегенерацией. Проект основан на четырех главных подходах: 1. Новые животные модели с направленной индукцией окислительного стресса в различных отделах мозга. Хемогенетический генератор пероксида водорода, оксидаза D-аминокислот (DAO), будет доставлен с помощью вирусных систем в нейроны.Далее, при введении животному субстрата этого фермента можно индуцировать в тех клетках, которые экспрессируют DAO, окислительный стресс, т.к. фермент генерирует пероксид водорода. Данный подход будет применен для моделирования in vivo нейродегенеративных заболеваний, что впервые позволит установить причинно-следственную связь между окислительным стрессом и нейродегенеративными расстройствами. 2. Геномный и протеомный анализ ответа мозга на окислительный стресс. 3. Создание и тестирование генотерапевтических препаратов, направленных на блокирование ферроптоза на основе нейротропных аденоассоциированных вирусов, кодирующих гены белков – протекторов мембран и блокаторов ферроптоза, таких как Gpx4 и Fsp1. 4. Платформы для имиджинга окислительного стресса в клетках и в органах живых модельных животных. Нами будет создана принципиально новая панель биосенсоров, основанных на флуорогенных белках, флуоресценция которых не зависит от присутствия кислорода, а спектральные характеристики позволяют осуществлять имиджинг в окне прозрачности биологических тканей. Кроме того, в рамках проекта мы разработаем панель конструкций для локализации в различных компартментах клетки сенсоров семейства Hypocrates для визуализации динамики гипогалогенного стресса.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Чеботарев А.С., Ледяева В.С., Пацап О.И., Иванов А.А., Федотов А.Б., Белоусов В.В., Шохина А.Г., Ланин А.А. Multimodal label-free imaging of murine hepatocellular carcinoma with a subcellular resolution Journal of Biophotonics, e202300228, p.1-10 (год публикации - 2023)
10.1002/jbio.202300228

2. Елена О. Петухова, Дмитрий И. Мальцев, Дарья Ю. Печинко, Андрей Л. Калиниченко, Всеволод В. Белоусов, Олег В. Подгорный The Endoplasmic Reticulum-Located TRPV1 Channel Is Not Thermal Sensitive ACS Chemical Biology, 20 (8), 1939-1950 (год публикации - 2025)
10.1021/acschembio.5c00306

3. Дмитрий И. Мальцев, Олег В. Подгорный Identification of De Novo Dividing Stem Cells Methods in Molecular Biology, pp 1-15 (год публикации - 2024)
10.1007/7651_2024_560

4. Виктория Г. Круть, Андрей Л. Калиниченко, Дмитрий И. Мальцев, Дэвид Джэппи, Евгений К. Шевченко, Олег В. Подгорный, Всеволод В. Белоусов Optogenetic and chemogenetic approaches for modeling neurological disorders in vivo Progress in Neurobiology, 235 (2024) 102600 (год публикации - 2024)
doi.org/10.1016/j.pneurobio.2024.102600

5. Шувалова М., Дмитриева А., Белоусов В., Носов Г. The role of reactive oxygen species in the regulation of the blood-brain barrier Tissue Barriers, (2024) 2361202 (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.1080/21688370.2024.2361202

6. Артем С. Чеботарев, Роман И. Раевский, Георгий Н. Линовский, Александр И. Костюк, Всеволод В. Белоусов, Андрей Б. Федотов, Дмитрий С. Билан, Александр А. Ланин Ultrafast supercontinuum for two-photon spectroscopy and microscopy of ratiometric fluorescent indicators Applied Physics Letters, 124 (2024) 243704 (год публикации - 2024)
10.1063/5.0197580

7. Дмитрий И. Мальцев, Максим А. Солотенков, Лиана Ф. Мухаметшина, Ростислав А. Соколов, Георгий M. Солюс, Дэвид Джэппи, Александра С. Цопина, Илья В. Федоров, Александр А. Ланин, Андрей B. Федотов, Виктория Г. Круть, Юлия Г. Ермакова, Александр А. Мощенко, Андрей Розов, Алексей М. Желтиков, Олег В. Подгорный, Всеволод В. Белоусов Human TRPV1 is an efficient thermogenetic actuator for chronic neuromodulation Cellular and Molecular Life Sciences , 81 (2024) 437 (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.1007/s00018-024-05475-x

8. Александр И. Костюк, Диана Д. Рапота, Ксения И. Морозова, Анна А. Федотова, Дэвид Джэппи, Алексей В. Семьянов, Всеволод В. Белоусов, Надежда А. Браже, Дмитрий С. Билан Modern optical approaches in redox biology: genetically encoded sensors and Raman spectroscopy Free Radical Biology and Medicine, 217 (2014) 68-115 (год публикации - 2024)
doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2024.03.010

9. Алексей П. Большаков, Константин Герасимов, Юлия В. Добрякова Alzheimer's Disease: An Attempt of Total Recall Journal of Alzheimer's disease: JAD, 101(4) (2024) 1043-1061 (год публикации - 2024)
DOI:10.3233/JAD-240620

10. Вероника С. Усатова, Натали М. Мишина, Михаил А. Берестовой, Александр В. Иваненко, Дэвид Джэппи, Виктория Г. Круть, Ростислав А. Соколов, Александр А. Мощенко, Андрей Розов, Евгений К. Шевченко, Всеволод В. Белоусов Hydrogen peroxide is not generated intracellularly in human neural spheroids during ischemia-reperfusion Free Radical Biology and Medicine, 212 (2024) 234-240 (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2023.12.039

11. Маргарита Шувалова, Георгий Носов Regeneration and reuse of transwell-type culture inserts for blood-brain barrier modelling Journal of Cellular Biotechnology (год публикации - 2024)
10.3233/JCB-240143

12. Артем С. Чеботарев, Илья В. Кельмансон, Александра Д. Иванова, Юлия В. Храмова, Вероника А. Катруха, Дарья А. Котова, Роман И. Раевский, Александр А. Мощенко, Георгий Н. Линовский, Андрей Б. Федотов, Всеволод В. Белоусов, Дмитрий С. Билан, Александр А. Ланин Multiphoton tools for hydrogen peroxide imaging in vivo with subcellular resolution Sensors and Actuators B: Chemical, 410 (2024) 135646 (год публикации - 2024)
10.1016/j.snb.2024.135646

13. Соколов Р.А., Круть В.Г., Белоусов В.В., Розов А.В., Мухина И.В. Hyaluronidase-induced matrix remodeling contributes to long-term synaptic changes Frontiers in Neural Circuits, 18, 1441280 (год публикации - 2025)
10.3389/fncir.2024.1441280

14. Дарья А. Котова, Александра Д. Иванова, Илья В. Кельмансон, Ксения И. Морозова, Юлия В. Храмова, Максим А. Солотенков, Евгений А. Степанов, Александр А. Мощенко, Алиса Б. Тяглик, Анна А. Федотова, Антон В. Залыгин, Владимир А. Олейников, Алексей Г. Катруха, Алексей Семьянов, Всеволод В. Белоусов, Андрей Б. Федотов, Илья В. Федотов, Надежда А. Браже, Дмитрий С. Билан Redox differences between neurons and astrocytes in vivo in ischemic brain tissues of rodents Antioxidants & Redox Signaling, 43 (4–6), 272-287 (год публикации - 2025)
10.1089/ars.2024.0876

15. Томас Пауленда, Барбора Эчалар, Люси Потукова, Вероника Вачова, Денис А. Клеверов, Йоханнес Мерингер, Екатерина Потехина, Алекс Джейкоби, Девашиш Сен, Крис Нельсон, Рик Стегеман, Владимир Сухов, Даниэль Кемпер, Шерил Ф. Лихти, Николас Джей Дэй, Тонг Чжан, Камила Хусарчикова, Моника Бамбускова, Дэвид Х. Фремонт, Вэй-цзюнь Цянь, Сергей Джуранович, Славица Павлович-Джуранович, Всеволод Белоусов, Анджей М. Крезель, Максим Н. Артемов Itaconate modulates immune responses via inhibition of peroxiredoxin 5 Nature Metabolism, с. 1-21 (год публикации - 2025)
10.1038/s42255-025-01275-0

16. Екатерина Потехина, Дина Басс, Дарья Езериня, Дарья Д Флекенштейн, Артем С Чеботарев, Вера А Сысоева, Дмитрий Мальцев, Валерий Пак, Александр Мощенко, Анатолий Соколов, Иван Н Мяснянко, Михаил С Баранов, Андрей Б Федотов, Алексей М Желтиков, Александр А Ланин, Йорис Мессенс, Всеволод Белоусов A color-tailored fluorogenic sensor for hydrogen peroxide Nature Chemical Biology, 1-12 (год публикации - 2025)
10.1038/s41589-025-02036-6

17. Алена А. Корягина, Юлия В. Добрякова, Константин А. Герасимов, Гофран Алхалаби, Александр А. Мощенко, Всеволод В. Белоусов, Алексей П. Большаков A Comparison of Transduction Efficiency of Medial Septal Neurons by Adeno-Associated Viruses with Three Promoters Journal of Neuroscience Methods, 424,110570 (год публикации - 2025)
10.1016/j.jneumeth.2025.110570

18. Маргарита Шувалова, Анастасия Дмитриева, Всеволод Белоусов, Георгий Носов BBBoid: A spheroid-based model for investigating blood-brain barrier permeability Journal of Cellular Biotechnology, 11(1), 14-23 (год публикации - 2025)
10.1177/23523689251340904

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Для реализации проекта по созданию животной модели болезни Альцгеймера был проведен анализ влияния хемогенетически индуцированного окислительного стресса на долговременную депрессию и ритмогенез в гиппокампе. В условиях окислительного стресса долговременная депрессия, одна из форм синаптической пластичности, участвующая в кодировании в мозге новой информации, полностью исчезает в течение нескольких минут. Индукция нейронального окислительного стресса избирательно снижает частоту и амплитуду гиппокампальных островолновых осцилляций, которые играют важную роль в преобразовании краткосрочной памяти в долговременную. Мы показали, что хронический хемогенетически вызванный окислительный стресс ухудшает целенаправленную деятельность, снижает память у животных, не влияя при этом на спонтанную локомоторную активность, а также вызывает дистрофию тканей гиппокампа. Также было показано, что экспрессия оксидазы D-аминокислот в клетках медиальной септальной области приводит к снижению уровня ацетилхолина в гиппокампе, а также к увеличению амплитуды долговременной потенциации в зоне СА1 гиппокампа. Дополнительная активация оксидазы с помощью D-норвалина возвращает амплитуду потенциации к норме и не влияет на уровень ацетилхолина. Таким образом, полученные на текущем этапе результаты подтверждают возможную ведущую роль хронического окислительного стресса в развитии возрастной деменции и болезни Альцгеймера. В ходе исследования, посвящённого моделированию болезни Паркинсона у грызунов, была проведена хемогенетическая индукция хронического окислительного стресса в дофаминергических нейронах чёрной субстанции. Это привело к заметной дегенерации нейронов и снижению уровня дофамина в стриатуме, что вызвало нарушение координации движений. На основе полученных данных была подана заявка на выдачу патента на изобретение новой модели болезни Паркинсона. В рамках изучения ферроптического вклада в исследуемые нейродегенеративные процессы получена панель частиц аденоассоциированных вирусов, несущих кДНК GPX4 и FSP1. Для последующей визуализации получены вирусные частицы AAV9 с геном GPX4-mRuby. Данная конструкция была успешно протестирована как на первичной нейрональной клеточной культуре, так и in vivo в тканях мозга крыс. Ткани мозга, куда были доставлены вирусные частицы, хорошо визуализируются по флуоресценции красного белка и демонстрируют повышенную примерно на 20% ферментативную активность глутатион пероксидазы, важнейшего антиоксидантного фермента. В рамках работы над созданием новых оптических платформ для изучения окислительного стресса была подана заявка на патент на изобретение «Многоцветный генетически-кодируемый флуорогенный биосенсор для обнаружения пероксида водорода в живых клетках» (HyPerFLEX). C использованием широких спектральных возможностей локализованных версий HyPerFLEX и ранее созданных сенсоров семейства HyPer продемонстрирована возможность одновременной детекции пероксида водорода в различных клеточных компартментах в условиях хемогенетически индуцируемого в митохондриях окислительного стресса. HyPerFLEX также показал свою эффективность при визуализации изменений уровня H2O2 в условиях длительной гипоксии. Кроме того, HyPerFLEX помог выявить небольшие изменения количества пероксида в митохондриях и цитоплазме на ранних этапах секреции инсулина бета-клетками, которые были стимулированы глюкозой. В продолжении работ по сенсорам для регистрации гипогалогенного стресса был исследован цитотоксический эффект различных представителей активных форм галогенов (HOCl, HOBr и N-хлоротаурин) на нейронподобные клетки линии Neuro2a в широком диапазоне времен воздействия и концентраций выбранных окислителей. Клеточная гибель происходит каспаза-независимым путем. По всей видимости, воздействие галогенирующих стрессоров на клетки вызывает две волны их гибели. Часть клеток погибает немедленно при контакте с окислителями, что приводит к некрозу. Вторая волна гибели клеток наступает позже и характеризуется апоптозом. На линии Neuro2a мы исследовали субклеточную динамику HOCl и N-хлоротаурина, добавленных в среду. Оказалось, что HOCl, а также N-хлоротаурин, беспрепятственно и практически одномоментно попадают во все компартменты эукариотической клетки (цитозоль, ядро, матрикс митохондрий) даже при очень малых дозах в диапазоне от 0,05 до 0,00001 пикомоля на одну клетку. Результаты получены с помощью усовершенствованного и детально охарактеризованного в рамках Проекта биосенсора Hypocrates-2.

Публикации