Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Во втором отчетном периоде исследования осуществляли по двум основным направлениям: изучению процесса эпимеризации дигидрокверцетина и оценке влияния примеси цис-диастереомера на антиоксидантные и цитотоксические свойства исследуемого флаванонола. В ходе изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе эпимеризации транс-дигидрокверцетина, опирались на термодинамические характеристики, рассчитанные в виртуальном пространстве программы HyperChem (v. 8.0.10, HyperCube) в условиях силового поля OPLS для молекулярной динамики, и кинетические параметры, полученные методом поляриметрии, спектроскопии ЯМР 1Н и ВЭЖХ. Термодинамические расчеты базировались на оценке свободной энергии молекулярных систем, исходя из двух возможных направлений реализации реакции: хинонметидный путь (эпимеризация по положению 2) и ендиольный путь (эпимеризация по положению 3). Результаты компьютерного расчета указывают, что образование хинонметида сопровождается поглощением энергии (+31 кДж/моль), в то время, как образование ендиола приводит к снижению энергии в системе (-108 кДж/моль). Однако дальнейший путь образование эпимера по положению 3 требует поглощения значительного количества энергии (+110 кДж/моль), в то время как образование эпимера по положению 2 представляется термодинамически выгодным процессом (-31 кДж/моль). На основании этих данных можно утверждать, что при рассмотрении реакции эпимеризации дигидрокверцетина как двухстадийного процесса (образование интермедиата и образование конечного продукта реакции) для хинонметидного пути лимитирующей стадией будет первый этап, реакция - обратимая при нормальных условиях; для ендиольного пути вторая стадия является лимитирующей, а сам процесс - не обратим при нормальных условиях. Согласно данным поляриметрии, удельное оптическое вращение водно-метанольного раствора дигидрокверцетина в щелочной среде смещается в большую сторону и течение 2 ч достигает плато, что косвенно свидетельствуют об образовании 2S,3R-дигидрокверцетина (эпимеризация по положению 2). Также, результаты, подтверждающие хинонметидный путь эпимеризации, получены методом спектроскопии ЯМР 1Н в ходе анализе раствора дигидрокверцетина в дейтерометаноле при 298 К и концентрации щелочи 0,01 моль/л. Внимание привлек дублет с величиной химического сдвига 5,76 м.д., который отсутствовал на спектре исходного вещества, а изменение его интенсивности коррелировало с изменениями интенсивности сигналов цис-дигидрокверцетина (r = -0.7484). Данный дублет был идентифицирован как сигнал водорода в положении 3 хинонметидного интермедиата. В ходе ВЭЖХ установлено, что эпимеризация дигидрокверцтина является двухстадийной бимолекулярной реакцией второго порядка, при этом каждая стадия является обратимой, а скорость реакции зависит от концентрации флавоноида и гидроксид иона. Равновесие между диастереомерами дигидрокверцетина устанавливается при достижении концентрации цис-изомера в 10,4±0,9%. Результаты, описанные выше, имеют важное значение для разработки лекарственных средств на основе дигидрокверцетина. Одним из основных трендов в этой области является получение жидких лекарственных форм на водной основе. Согласно результатам, полученным в ходе реализации данного проекта, в силу присутствия гидроксид ионов в воде, в такой готовой лекарственной форме неминуемо будет протекать эпимеризация. Следовательно, для подобных препаратов возможно потребуется предусмотреть введение компонентов, подавляющих химическую трансформацию, и введение нормативов регламентирующих примесь цис-изомера. Более того, водные растворы в совокупности с высокими температурами и/или щелочными модификаторами среды не редко применяют для экстракции дигидрокверцетина из лекарственного растительного сырья - подобная практика также ведет к накоплению цис-диастереомера в субстанции флаванонола. В то же время, в ходе реализации данного проекта не обнаружено статистически значимого эффекта от ионизирующего излучения величиной 9,5 МэВ на химический (в том числе - стереохимический) состав дигидрокверцетина. Таким образом, подтверждена безопасность данного способа обработки для конечных потребителей, что может быть использовано для обоснования внедрения данного метода деконтаминации в фармацевтическую производственную практику. Оценку антиоксидантных свойств образцов дигидрокверцетина, содержащих различные доли примеси цис-диастереомера, проводили на модели ABTS•+ под контролем спектрофотометрического анализа (Cary 1C, Varian) в максимуме поглощения катион-радикала при длине волны 730 нм. При добавлении образцов, содержащих 0,8%, 3,7% и 9,5% цис-изомера, оптическая плотность по истечении 6 мин снизилась на 0,588±0,008, 0,581±0,017 и 0,602±0,012, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о сопоставимом снижении количества свободных радикалов в реакционной смеси и указывает на отсутствие статистически значимого влияния диастереомерного состава на антиоксидантные свойства образцов дигидрокверцетина. Оценку цитотоксичности проводили на модельных линиях клеток СaCo-2, HEK293, HUVEC и 3T3. Культивирование клеток осуществляли в соответствии со стандартным протоколом. Тест осуществляли с применением набора для подсчета клеток (CCK-8) под контролем спектрофотометрии (Eon, BioTek) в максимуме поглощения восстановленной формы WST-8 при 450 нм. В ходе регрессионного анализа полученных данных установлен линейный характер прямой зависимости между содержанием примеси цис-диастереомера флаванонола и значением IC50 для исследуемых клеточных линий: значение коэффициентов корреляции составило 0,9897, 0,8235, 0,9878 и 0,9820 для клеток линии HEK293, 3Т3, HUVEC и Сасо-2, соответственно. В свою очередь, итоги двухфакторного дисперсионного анализа свидетельствуют о статистически значимой разнице в уровнях выживаемости клеток линии HEK293 (p = 0,00001) и HUVEC (p = 0,00443) на фоне различного содержания цис-диастереомера. Аппроксимируя результаты выявленных закономерностей, значения IC50 цис-дигидрокверцетирна - на порядок больше, чем у транс-изомера. Полученные данные коррелируют с результатами молекулярного докинга, выполненного в программе Webina (v. 1.0.5., DurrantLab): значение аффинности по отношению к биологическим мишеням для цис-дигидрокверцетина было на 1,96-1,04 ккал/моль меньше по модулю, чем у транм-диастереомера. Результаты данного проекта позволяют утверждать, что наблюдаемые биологические эффекты дигидрокверцетина не обязательно коррелируют с его антиоксидантными свойствами и могут быть обусловлены аффинностью стереоизомера флаванонола по отношению к конкретным биологическим мишеням. Таким образом, подтверждено, что для разработки эффективных и безопасных лекарственных средств на основе дигидрокверцетина требуется контроль диастереомерного состава.