Роль белков-регуляторов программируемой гибели клеток в развитии патологий

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-74-30006

НазваниеРоль белков-регуляторов программируемой гибели клеток в развитии патологий

Руководитель Копеина Гелина Сергеевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук , г Москва

Конкурс №81 - Конкурс 2023 года по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология

Ключевые слова программируемая гибель клеток, апоптоз, аутофагия, патология, каспазы, нокаут, некроптоз, карцинома яичника, аденокарцинома легкого

Код ГРНТИ76.00.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В течение жизни организма большое количество клеток, как у позвоночных, так и беспозвоночных, погибает. Так удаляются целые ткани или органы, выполнившие свои функции. Во второй половине 20 века обнаружили, что этот процесс может быть регулируемым и ввели термин «программируемая гибель клеток» (ПГК), а также стали рассматривать апоптоз, как важный биологический механизм регуляции гомеостаза тканей. Преждевременная гибель клеток характерна для многих нейродегенеративных (Болезнь Алцгеймера, Болезнь Паркинсона и т.д.) и иммунологических (СПИД) заболеваний. Отсутствие своевременной гибели клеток характерно для опухолевых заболеваний. ПГК наиболее быстро развивающаяся область биомедицины и единственная, отмеченная тремя Нобелевскими Премиями по Физиологии или Медицине в 21 веке (2002, 2016 и 2018 гг). На сегодня описано 12 различающихся по механизмам типов ПГК, между которыми существуют точки взаимодействия. Подавляя/активируя один тип гибели можно влиять на другой. Это принципиально важно для регуляции чувствительности опухолевых клеток к терапии. Накоплены данные о том, что большинство генов/белков участвующих в регуляции ПГК, выполняют "нормальные" функции в организме и в случае активации ПГК переключаются на ее регуляцию. Ранее с помощью метода CRISPR/Cas9 нами получены мыши, нокаутированные по гену проапоптотического белка - каспазы-2 (см Рисунки 1-4). Для анализа из семи полученных клонов были взяты в работу две линии мышей с нокаутом гена каспазы-2, чтобы исключить побочные последствия метода CRISPR/Cas9. Нами впервые у нокаутных самок обнаружена частичная или полная редукция ооцитов с избыточным развитием (гиперплазией) желтых тел. Попытки получить потомство от скрещивания нокаутных самок с самцами не дали результатов. Более того, они не могли выносить потомство, даже после подсадки здоровых эмбрионов. Так как неспособность дать потомство не исключает наличия патологии матки и половой эндокринной системы, мы проведем патоморфологическое исследование матки и яичников таких мышей в различном возрасте, начиная с неонатаального периода, а также гормонального статуса и их ЭКО. Для выяснения молекулярных механизмов бесплодия самок, мы проведем RNAseq и протеомный анализ желтых телец и яичников нокаутных и здоровых самок. Таким образом, будет исследован механизм возникновения бесплодия при повреждении гена каспазы-2. Поскольку каспаза-2, помимо апоптоза имеет ряд неапоптотических функций (см Графический абстракт, рис. 5), нами будет исследована ее роль в детекции повреждений ДНК, во взаимодействии с аутофагическим белком р62, влияние на функции митохондрий. Ранее мы показали, что взаимодействие между различными формами ПГК могут влиять на ответ опухолей на терапию. Поэтому будут исследованы механизмы модуляции гибели клеток, вызванной противоопухолевыми препаратами в условиях таргетирования соединениями, воздействующими на митохондрии. Мы проанализируем изменение уровня белков, регулирующих разные формы ПКГ (апоптоз, некроптоз, аутофагию) в опухолевых тканях по отношению к нормальным у пациентов с карциномой яичника и аденокарциномой легкого. Далее будет определена корреляция между изменениями уровня этих белков в паре опухоль/нормальная ткань и прогрессированием заболевания, а также построены номограммы для прогнозирования течения аденокарциномы легкого. В результате проекта будут получены фундаментальные данные о том каким образом нарушения ПГК отражаются на патогенезе таких заболеваний как бесплодие и рак. Эти знания будут использованы в качестве основы для разработки новых подходов, способствующих повышению эффективности терапии вышеуказанных заболеваний. Условиями для успешного выполнения проекта являются наличие: (а) команды, включающей как опытных, так и молодых исследователей, обладающей опытом в исследовании различных форм ПГК; (б) предварительно полученных интересных и перспективных результатов; (в) имеющегося оборудования для проведения экспериментов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Копеина Г.С, Животовский Б. The new face of autophagy in Chronic Lymphocytic Leukemia Cancers, 15, 21, 5279 (год публикации - 2023)
10.3390/cancers15215279

2. Волик П.И., Копеина Г.С., Животовский Б., Замараев А.В. Total recall: the role of PIDDosome components in neurodegeneration Trends in Molecular Medicine, 29, 12, 996-1013 (год публикации - 2023)
10.1016/j.molmed.2023.08.008

3. Первушин Н.В., Копеина Г.С. Животовский Б. Bcl-B: An “unknown” protein of the Bcl-2 family Biology Direct, 18, 1, 69 (год публикации - 2023)
10.1186/s13062-023-00431-4

4. Горбунова А.С., Замараев А.В., Япрынцева М.А., Кавалева О.В., Чевкина Е.М., Туркина М.В., Животовский Б., Копеина Г.С. Prognostic signature based on mitochondria quality control proteins for the prediction of lung adenocarcinoma patients survival Cell Death Discovery, 9(1):352 (год публикации - 2023)
10.1038/s41420-023-01649-x

5. Волик П.А., Замараев А.В., Егоршина А.Ю., Первушин Н.В., Капуста А.А., Тюрин-Кузьмин П.А., Липатова А.В., Кехне Т., Лаврик И.Н., Животовский Б., Копеина Г.С. Ally or traitor: the dual role of p62 in caspase-2 regulation Cell Death Dis., 15, 827. (год публикации - 2024)
10.1038/s41419-024-07230-3

6. Япрынцева М.А., ЖивотовскийБ., Гогвадзе В. Permeabilization of the outer mitochondrial membrane: Mechanisms and consequences Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis., 1870, 167317 (год публикации - 2024)
10.1016/j.bbadis.2024.167317

7. Чесноков М.С., Мамедова А,Р., ЖивотовскийБ., Копеина Г.С. A matter of new life and cell death: programmed cell death in the mammalian ovary J. Biomed. Sci, 31, 31 (год публикации - 2024)
10.1186/s12929-024-01017-6

8. Сазонова Е.В., Япрынцева М.А., Первушин Н.В., Цветков Р.И., Животовский Б., Копеина Г.С. Cancer drug resistance: Targeting proliferation or programmed cell death Cells, 2024, 13, 388. (год публикации - 2024)
10.3390/cells13050388

9. Чен Х., Цветков А.С., ..Животовский Б., Клионский Д.Ж., Кроемер Г., Танг Д. International consensus guidelines for the definition, detection, and interpretation of autophagy-dependent ferroptosis Autophagy, 20, 1213-1246 (год публикации - 2024)
10.1080/15548627.2024.2319901

10. Гунбин К.В., Копеина Г.С., Животовский Б., Замараев А.В. Features of the CD1 gene family in rodents and the uniqueness of the immune system of naked mole-rat. Biol. Direct, 19, 58 (год публикации - 2024)
10.1186/s13062-024-00503-z

11. Первушин Н.В., Нилов Д.К., Пушкарев С.В., Шипунова В.О., Бадлаева А.С., Япрынцева М.А., Копытова Д.В., Животовский Б., Копеина Г.С. BH3-mimetics or DNA-damaging agents in combination with RG7388 overcome p53 mutation-induced resistance to MDM2 inhibition Apoptosis, 29, 2197–2213 (год публикации - 2024)
10.1007/s10495-024-02014-8

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Каспаза-2 участвует в запуске гибели в ответ на повреждения ДНК, регуляции пролиферации и дыхания. Обнаружено, что белок аутофагии р62 способствует как деградации, так и активированию каспазы-2, обеспечивая ее димеризацию при генотоксическом стрессе. При этом убиквитин-связывающие домены ZZ и UBA р62 отвечают за взаимодействие с каспазой-2. Таким образом, в норме взаимодействие каспаза-2 и р62 приводит к протеасомной деградации фермента. Повреждения ДНК вызывают убиквитинирование каспазы-2, что усиливает взаимодействие этого белка с р62 и обеспечивает активацию каспазы. Каспаза-2 влияет на детекцию повреждений ДНК через фосфорилирование гистона H2AX. Показано, что нокаут каспазы-2 снижает уровень активной формы JNK1/2, но не ATM, ATR, DNA-PK. Именно эти 4 киназы фоcфорилируют H2AX. Таким образом, каспаза-2 усиливает фосфорилирование гистона H2AX через активность киназы JNK. Самки Casp2-/- мышей характеризуются бесплодием, но неизвестно, возникает ли беременность в принципе. Оценка разных возрастных групп показала, что вероятность зачатия у Casp2-/- мышей значительно снижена по сравнению с WT. Важно, что при таком снижении у Casp2-/- самки завязывается лишь по 2 эмбриона по сравнению с 7-10 у мышей WT, и неизвестно, выживают ли они дальше. Аномальное накопление желтых тел характерно для Casp2-/- самок в возрасте 70-90 дней. Анализ протеома желтых тел показал, что у Casp2-/-самок повышается уровень белков ANXA4 и S100A6, которые регулируют деградацию желтых тел. Мы проанализировали ключевые стероидные гормоны в стадии диэструса мышей при полной половозрелости 70-90 дней. Уровни всех стероидных гормонов у Casp2-/- и WT групп не отличались, т.е. избыточные желтые тела были нефункциональны. Самки 40-50 дней обладали нормальным строением яичника, но у них есть проблемы с фертильностью, следовательно, накопление желтых тел не является первопричиной бесплодия Casp2-/- мышей. RNAseq aнализ ткани яичников показал, что у нокаутов изменена экспрессия генов, связанных с организацией цитоскелета клетки и участвующих в функционировании жгутиков. Это говорит о проблеме выхода и продвижения яйцеклеток во время естественного гормонального цикла. Анализ данных из баз данных TCGA трех типов рака, BRCA, LUAD и LIHC,показал, что повышенная экспрессия гена каспазы-2 в этих опухолях положительно коррелирует с геномными изменениями, анеуплоидией, LoF мутациями в гене р53 и измененной экспрессией генов репарации ДНК/репликации ДНК. Белок р53 является важным онкосупрессором. Сейчас идут клинические испытания низкомолекулярных ингибиторов негативного регулятора р53 - белка MDM2 - для лечения нейробластомы. К таким таргетным препаратам быстро развивается лекарственная устойчивость. Исследование устойчивых к ингибитору MDM2 клеток нейробластомы указывало на нарушение работы р53 как транскрипционного фактора. В таких клетках произошла замена His193A в p53, которая вызывала перестройку структуры белка и ингибировала его функцию как транскрипционного фактора. При этом доксорубицин и цисплатин обладали низкой эффективностью в устойчивых клетках по сравнению с исходными клетками как в in vitro, так и in vivo моделях. Исследование способов преодоления устойчивости показало, что цисплатин и ВН3-миметики в комбинации с ингибитором MDM2 вели к частичному или полному преодолению резистентности клеток к препаратам. Устойчивость к препаратам может развиваться из-за изменения скорости пролиферации клеток или нечувствительности к запуску ПГК. Анализ устойчивых к цисплатину клеток разного происхождения показал, что резистентные клетки одной линии отличались сниженным уровнем апоптоза в ответ на генотоксический стресс, а другие изменяли скорость пролиферации. Многие противоопухолевые препараты влияют на митохондрии, a развитие рака находится под глубоким метаболическим контролем. Kаспазa-2, обладающая онкосупрессорными функциями, также влияет на работу митохондрий. КО-с2 клетки характеризовались увеличением базального и разобщенного дыхания митохондрий, а также продукцией АФК. В этих клетках значительно увеличивалась активность дыхательного комплекса II и рос уровень его компонента - белка SDHB. Показано, что в отсутствии каспазы-2 увеличивается уровень р53, который регулирует транскрипцию белков TIMM21, TIMM23, TOMM20 и TOMM40, ответственных за транслокацию SDHB. Таким образом, p53 является медиатором сигнального пути каспазы-2, регулирующего экспрессию генов, связанных с работой митохондрий. Иммунотерапия является важным подходом в лечении пациентов с НМРЛ. Анализ клинико-патологических характеристик пациентов с НМРЛ, получающих разную терапию, показал, что одним из перспективных клинических параметров с хорошей прогностической способностью является отношение нейтрофилов к лимфоцитам (NLR). На основании NLR пациенты были разделены на группы высокого и низкого риска. Группа высокого риска с высоким отношением нейтрофилов к лимфоцитам (>3.3) показала заметное снижение выживаемости пациентов по отношению к группе низкого риска с низким NLR при комбинированном лечении. Установлено, что комбинированная терапия значимо увеличивает выживаемость без прогрессии заболевания у пациентов в двух группах риска. Параметр отношения нейтрофилов к лимфоцитам может быть использован для прогнозирования общей и беспрогрессивной выживаемости. Для разработки терапии, в том числе и иммунной, проводят доклинические испытания на мышах. При этом разница в иммунном ответе мышей как грызунов и человека как примата может влиять на ответ организма на воздействие препаратов. При анализе возможных разночтений в иммунном ответе обнаружено, что у грызунов и приматов отличаются гены семейства CD1, которые отвечают за презентацию липидов патогенов. Показано, что среди грызунов долгоживущий голый землекоп утерял в ходе эволюции функциональный ген CD1d, следовательно, иммунный ответ у него осуществляется по пути, независимому от этого белка и NKТ-клеток.

Публикации

1. Копеина Г.С, Животовский Б. The new face of autophagy in Chronic Lymphocytic Leukemia Cancers, 15, 21, 5279 (год публикации - 2023)
10.3390/cancers15215279