Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На отчетном этапе проекта были проведены следующие работы: • Разработан подход к удалению неупорядоченных сегментов белка Sup35NM-GFP для улучшения реконструкции фибрилл. В качестве подходов, облегчающих реконструкцию структуры и препятствующих латеральной ко-агрегации фибрилл, применены изменения рН, отказ от хранения конечного образца в замороженном виде, использование укороченных версий белка Sup35, и протеолитическое отщепление неупорядоченной части белка. Наиболее перспективным оказалась мутантная форма Sup35DE-GFP, в которой кластер из заряженных аминокислотных остатков, экспонируемый наружу после энзиматического удаления неупорядоченной части амилоида, предотвращает ко-агрегацию фибрилл. • Было установлено, что фибриллы амилоида Sc37 обладают более высокой термостабильностью, чем амилоида Sc4. При трансфекции клеток дрожжей этими типами фибрилл амилоид Sc4 формирует более "сильные" варианты приона [PSI+], чем амилоид Sc37. • Установлено, что N-концевое положение амилоидогенных последовательностей белка Sup35 важно для формирования амилоидных структур. При присоединении к N-концу последовательностей с разной степенью амилоидогенности та область белка, которая участвует в образовании протеазо-устойчивых структур, имеет тенденцию к смещению в сторону новообразованного N-конца белка. • Была проведена витрификация и скрининг амилоидных фибрилл варианта Sc4, образованных in vitro белком Sup35NM, а также прионных фибрилл Sup35DE-GFP («сильный» прионный вариант S) с удалением GFP и неупорядоченных сегментов Sup35. Для прионных фибрилл варианта S была проведена двумерная классификация 5 630 частиц. Для варианта Sc4 была проведена реконструкция структуры низкого разрешения. Также методом крио-ЭМ были получены изображения прионных фибрилл GFP-Rnq1 (прионный вариант [RNQ+]-high). • По направлению светособирающие комплексы основным объектом исследования является светособирающий комплекс LH2 дикого типа из пурпурной серной бактерии Ect. haloalkaliphila, которая экспрессирует данные комплексы для эффективного поглощения и преобразования солнечного света в процессе фотосинтеза. Из активной культуры клеток были получены фотосинтетические мембраны, из которых хроматографически выделены светособирающие комплексы LH2 дикого типа. • Получена оценка ряда биохимических характеристик светособирающего комплекса LH2 с помощью спектральных методов (спектрофотометрия и круговой дихроизм). Исследование термостабильности LH2 методом кругового дихроизма выявило начало перехода тепловой денатурации белковой части комплекса при 40 °С. Фотоустойчивость комплекса была оценена спектрофотометрически при облучении сине-зеленым и красным светом. • В рамках исследования был проведен анализ пигментного состава комплекса с помощью методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии (МС). Анализ ВЭЖХ показал наличие пяти различных каротиноидов спириллоксантинового пути, основными из которых являются ангидрородовибрин (36.8 моль%), ликопин (30.6 моль%) и спириллоксантин (20.9 моль%). Данные результаты дополнены результатами МС анализа, показавшего дополнительно наличие в препарате смеси различных полипептидов. • Осуществлен подбор условий витрификации, обеспечивающих равномерное распределение препарата в отверстиях сетки для крио-ЭМ в целях получения данных высокого разрешения. Проведен сбор крио-ЭМ данных на просвечивающем криоэлектронном микроскопе Titan Krios 60-300 (НИЦ «Курчатовский институт»). В результате обработки данных получена крио-ЭМ карта комплекса с симметрией C8 и установлена структура комплекса LH2 c разрешением 1.7 Å (наилучшее на сегодняшний момент для объектов данного класса). Для определения полипептидного состава комплекса получен драфт-геном бактерии. Обнаружено шесть пар генов pucBA, кодирующих β- и α-полипептиды LH2, соответственно. Исходя из данных МС и набора аминокислот, видимых в крио-ЭМ плотности, выявлены доминантные полипептиды LH2. Кроме того, на основе крио-ЭМ плотности, а также данных ВЭЖХ определен наиболее вероятный тип каротиноида в комплексе - ангидрородовибрин. Проведен детальный структурный анализ комплекса LH2. Выявлена сеть водородных связей, а также канонические аминокислотные остатки, координирующие пигменты. Проведен сравнительный анализ четырех структур LH2 с разным количеством субъединиц из пурпурных серных и несерных бактерий. В результате сравнительного анализа выявлено, что структура комплекса LH2 из Ect. haloalkaliphila значительно отличается от единственной ранее известной LH2 из серной бактерии Mch. purpuratum. • Полученные в ходе выполнения проекта данные вносят существенный вклад в фундаментальные знания об организации светособирающих комплексов пурпурных бактерий, функционировании и свойствах пигментов в этих комплексах и могут быть полезны в будущем для разработки искусственных систем сбора и преобразования солнечной энергии на основе светособирающих комплексов. • По результатам работ опубликованы две статьи в журналах из первого квартиля. Еще одна статья находится на стадии рецензирования в журнале из первого квартиля, текст статьи опубликован в виде препринта.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
По направлению прионы: С использованием уникального объекта инфраструктуры, криоэлектронного микроскопа Titan Krios были получены крио-микрофотографии прионных фибрилл на основе белка дрожжей Sup35, соответствующие так называемому «сильному» варианту приона S7. На основе этих фотографий была проведена реконструкция структуры амилоидного стебля (ядра) прионных фибрилл («Структура 1») с разрешением 2,7 Å, что считается очень хорошим разрешением. Это первая в мире полноатомная структура приона дрожжей. В данную структуру вошла область белка Sup35 со 2 по 64 аминокислотный остаток, что достаточно хорошо согласуется с протяженностью Структуры 1 для данного прионного варианта, определенной с помощью протеазного картирования (остатки 2–72). Данное совпадение важно, поскольку ставит под сомнение многие структурные работы по амилоидам Sup35, сформированным in vitro, опубликованным в журналах уровня Nature, так как протеазное картирование амилоидов соответствующих сильному варианту приона Sup35 дает гораздо меньший размер структуры, примерно 40 аминокислотных остатков. Это указывает на необходимость изучения структуры прионов на реальных препаратах, извлеченных из клеток, а не на их синтетических аналогах. Но сейчас только наша лаборатория совершает такие работы и владеет всеми требуемыми технологиями. В полученной нами структуре полипептидные нити расположены параллельно и в регистре, а каждая молекула Sup35 образует один слой толщиной в одну нить, или 0,48 нм, перпендикулярный оси фибриллы. В регистре означает, что одинаковые аминокислотные остатки соседних молекул Sup35 (протомеров) находятся в непосредственной близости. Протомер Sup35 образует тип укладки в литературе называемый «амилоидным ключом». В молекуле протомера происходят «горизонтальные» внутримолекулярные взаимодействия между боковыми цепями аминокислот, стабилизирующие структуру в плоскости, перпендикулярной оси фибриллы. Полученная структура приона S7 дала возможность рассчитать ее энергетические параметры и сравнить их с таковыми для других амилоидов с опубликованной структурой и вариантов приона PrPSc. Энергия Гиббса (free energy of unfolding, ΔGUnf), для приона S7 оказалась значительно ниже, чем у известных функциональных амилоидов, что означает большую прочность S7. Для «слабого» варианта W2 также были получены микрофотографии выделенных из дрожжей прионных фибрилл. Однако большинство этих фибрилл не обладало спиральной закрученностью, которая является важной предпосылкой и стартовой точкой успешной компьютерной реконструкции. На данный момент нам удалось провести реконструкцию фибрилл W2 лишь с низким разрешением около 8-10 Å. В рамках исследований светособирающих комплексов получена активная культура клеток Ectothiorhodospira (Ect.) haloalkaliphila, культивированная на среде с дифениламином (ДФА) - ингибитором биосинтеза каротиноидов. Из двух типов клеток (контрольные и с подавленным синтезом каротиноидов) были выделены комплексы LH2 (контрольный вариант) и dpaLH2 (с ингибированием). Проведён комплексный анализ комплекса dpaLH2: изучены спектральные характеристики (поглощение, флуоресценция, оптическая активность) и выполнен ВЭЖХ-анализ пигментного состава. Было установлено, что ингибирование биосинтеза каротиноидов у Ect. haloalkaliphila с помощью ДФА приводит к включению в комплексы LH2 бесцветных каротиноидов с ранних этапов биосинтеза (в основном фитоина), которые заменяют нативные окрашенные каротиноиды и необходимы для стабилизации комплексов. Впервые для пурпурных бактерий была получена крио-ЭМ структура комплекса dpaLH2 с разрешением 1.92 Å, в которой нативные окрашенные каротиноиды были заменены на неокрашенный фитоин. Анализ этой структуры показал, что фитоин занимает те же структурные позиции, что и окрашенные каротиноиды в нативном LH2, поддерживая целостность комплекса за счет консервативных взаимодействий с бактериохлорофиллом и полипептидами. Несмотря на частично измененную морфологию детергентных мицелл и спектральные различия, общая архитектура dpaLH2 практически идентична нативному комплексу, включая его симметрию C8, положение и ориентацию пигментов. Сохранение фитоина в комплексе - несмотря на его неспособность поглощать видимый свет - подчеркивает важную структурную роль каротиноидов в сборке LH2. Более того, жизнеспособность клеток, обработанных ДФА, позволяет предположить, что окрашенные каротиноиды не являются обязательными ни для формирования комплекса, ни для выживания клеток, хотя их отсутствие может негативно влиять на функциональную эффективность. Структурная сохранность комплекса LH2 в условиях ингибирования биосинтеза каротиноидов раскрывает фундаментальные принципы стабильности комплексов у пурпурных серных бактерий. Также, методом крио-ЭМ была реконструирована структура фикобилисомы Gloeobacter violaceus (GviPBS) - крупнейшего из известных комплексов этого типа (масса  более 10 МДа, размеры 450 × 550 Å). В ходе исследования было установлено, что данный мегакомплекс характеризуется расходящимися конформационно подвижными пучками стержней. Стержни сформированы гексамерами фикоэритрина и фикоцианина. Ядро имеет конфигурацию «3+2» и расширено латеральными PC гексамерами. Мегакомплекс содержит 82 тримера фикобилипротеинов и 864 билиновых хромофора. Уникальная архитектура фикобилисомы поддерживается двумя специфичными для Gloeobacter мультидоменными линкерными белками - Glr1262 и Glr2806. Полученные результаты расширяют представление о морфологическом разнообразии светособирающих комплексов, демонстрируют связь между структурной организацией фикобилисом и эффективностью фотосинтеза, открывают возможность для дальнейших функциональных исследований.