Аннотация результатов, полученных в 2024 году
1. Получены экзосомы из клеточных линий колоректального рака человека HT29 и HCT116, из плазмы крови пациентов больных колоректальным раком на 4 стадии заболевания до и после лечения, и от здоровых добровольцев. Проведено измерение основных физико-химических параметров экзосом (гидродинамический диаметр, концентрация, концентрация белка). Получены изображения экзосом методом просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения и проведен анализ морфологии и размера везикул. Проведено исследование мембранных маркеров экзосом методами вестерн-блоттинга и дот-блоттинга. Анализ полученных данных позволил определить экспрессию характерных экзосомальных маркеров семейства тетраспанинов CD63, CD9 и маркера эпителиального фактора роста EpCAM, сверэкспрессиия которого характерна также и для опухолевых тканей. Выявлена экспрессия уникального мембранного маркера CPNE3 в экзосомах, полученных из плазмы крови пациентов до терапевтического лечения. При этом экспрессия данного маркер отсутствовала в экзосомах, выделенных из плазмы крови пациентов, которые получали терапевтическое лечение. Установлено общее снижение концентрации экзосом в образцах для пациентов после лечения по сравнению с образцами экзосом пациентов до лечения, и как следствие снижение экспрессии маркера CD63 в образцах экзосом для пациентов после лечения. Проведено измерение образцов экзосом клеточных линий, пациентов до и после лечения, и здоровых добровольцев методом масс-спектрометрии. Проведен анализ полученных данных, который после фильтрации данных выявил 875 экзосомальных белков во всех измеренных образцах. Установлено, что 22 белка являются уникальными и встречаются только в образцах экзосом, полученных от пациентов до терапевтического лечения, при этом 16 из них идентифицируются как везикулярные. Количественное определение белков по параметру iBAQ (intensity Based Absolute Quantification) выявило наличие белков крови, которые участвуют в поддержании гемостаза и иммунного ответа. 2. Проведено исследование взаимодействия экзосом, выделенных из клеточной линии колоректального рака человека HCT116, с магнитными микросферами, содержащих молекулы дубильной кислоты на поверхности. Получены данные о концентрации везикул и белка в надосадочной жидкости (супернатанте), на основании которых установлено, что эффективность связывания экзосом с поверхностью магнитных микросфер, содержащих молекулы дубильной кислоты, составляет порядка от 50 до 60% в зависимости от типа полиэлектролитной оболочки на микросферах. Наибольшую эффективность связывания порядка 60% показали микросферы, оболочка которых была сформирована из дубильной кислоты в паре с бычьим сывороточным альбумином или полиалиламиногидрохлорида. Найдено, что отсоединение экзосом с поверхности магнитных микросфер с эффективностью более 50% может быть выполнено путем инкубации образцов в 0,1% Tween-20. Измерения ядерного-магнитного резонанса и масс-спектрометрии комплексов дубильной кислоты/фосфатидилхолина и дубильной кислоты/бычьего сывороточного альбумина позволили предсказать возможный механизм взаимодействия молекул дубильной кислоты с экзосомами. Практическое применение разработанного подхода было протестировано на выделении экзосом из супернатанта клеточной линии колоректального рака человека HCT116. Эффективность выделения с применением магнитных микросфер оказалась сопоставима с эффективностью выделения экзосом методом эксклюзионной хроматографии, при этом время, затрачиваемое на выделение везикул с помощью магнитных микросфер, оказалось в 2 раза ниже. 3. Отработана методика окрашивания экзосом липофильным флуоресцентным красителем, для задач регистрации экзосом флуоресцентными методами исследования. Окрашенные экзосомы были применены для исследования взаимодействия экзосом, находящимися в модельном растворе плазмы крови с магнитными микросферами, содержащими молекулы дубильной кислоты на поверхности. Было исследовано влияние количества циклов инкубации экзосом с магнитными микросферами и количества магнитных микросфер, добавляемых к экзосомам на связывание везикул с магнитными микросферами. Выявлено связывание компонентов плазмы крови (бычий сывороточный альбумин) с магнитными микросферами и крайне низкий характер взаимодействия экзосом с молекулами дубильной кислоты на поверхности магнитных микросфер. Установлено, что применение магнитных микросфер, содержащих молекулы дубильной кислоту на поверхности малоэффективно для захвата экзосом, находящихся в плазме крови. 4. Доработана и оптимизирована технология функционализации магнитных наносфер аптамерами, специфичных к мембранным белкам экзосом. Были определены: 1) оптимальная концентрация стрептавидина (0,1 мг) при реакции биоконъюгации с магнитными наносферами (1 мг); 2) оптимальная концентрация биотинулированного аптамера (75 нМ) для связывания с магнитными наносферами, функционализированных стрептавидином; 3) оптимальное количество магнитных наносфер со стрептавидином (0,4 мг) для эффективной конъюгации с биотинулированным аптамером. Найденные параметры были использованы для получения конъюгата магнитных наносфер со стрептавидином и биотинилированного аптамера анти-EpCAM. Установлено, что магнитные наносферы, покрытые стрептавидином, образуют устойчивый комплекс с биотинилированным анти-EpCAM аптамером и эффективно захватывают экзосомы из культуральной среды клеток рака кишечника HT29. Проведена количественная оценка экзосом, окрашенных липофильным красителем, с помощью метода флуоресцентной проточной цитометрии. Показано успешное определение окрашенных EpCAM-положительных экзосом в диапазоне концентраций 107-109 везикул/мл. 5. Во второй год выполнения проекта по результатам проведенных работ была опубликована 1 публикация (с учетом квартиля 2 публикации) в изданиях, индексируемых Web of Sciense или Scopus. Подготовлена публикация и отправлена в редакцию журнала «Трансляционная медицина», тематический номер журнала «Внеклеточные везикулы: большие перспективы маленьких объектов» (получено положительное решение о принятие публикации к печати, РИНЦ). По достигнутым результатам исследования подана заявка на регистрацию РИД (“Способ выделения экзосом из биологических жидкостей с помощью частиц, модифицированных дубильной кислотой”, патент на изобретение, 07.11.2024, W24074151, 2024133371) 6. Информация о проекте размещена в сети Интернет: https://rscf.ru/news/release/magnitnye-chastitsy-s-dubilnoy-kislotoy-uprostyat-diagnostiku-raka-na-rannikh-stadiyakh/ https://faculty.skoltech.ru/people/alexeyyashchenok http://biophotonicsskoltech.ru/#projects https://nauka.tass.ru/nauka/21242983 https://digital.gov.ru/ru/events/51751/ https://www.1tv.ru/publikacii/obzor-smi/v-rossii-sozdali-magnitnye-mikrochasticy-dlya-bystrogo-vyyavleniya-opuholey