Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На втором этапе проекта исследование миграции клеток осуществлялось по поверхности монослоя эндотелиальных клеток с использованием модели, разработанной на предыдущем этапе. Отсутствие градиента хемоаттрактации в контроле приводило к стохастической миграции клеток в разных направлениях. Такое же поведение отмечено и для клеток при использовании биохимических хемоаттрактантов. Вероятнее всего отсутствие направленного вектора движения можно объяснить быстрой диффузией и распределением низкомолекулярных хемоаттрактантов во всем объеме, без создания выраженного градиента. В пользу этого говорит тот факт, что клетки не только активно двигались, но и продуцировали большое количество АФК (максимальная продукция отмечена для эндотелиоцитов при активации TNFα). При использовании низкомолекулярных хемоаттрактантов (TNFa, LTB4, LXA4) нейтрофилы больше проявляли склонность к формированию адгезионных контактов с эндотелиоцитами. Возможность гиперадгезии была показана ранее в случае использования LXA4. Была выявлена существенная вариабельность в миграционной активности нейтрофилов в зависимости от используемого бактериального хемоаттрактанта. В этом случае диффузия ограничивалась малым размером пор диализной мембраны (до 14 кДа), поэтому градиент создавался, благодаря проникновению из камеры только низкомолекулярных факторов патогенности бактерий. В частности, наличие в камере Enterococcus faecalis 645-р2 приводило к дезориентации нейтрофилов и их движению от контейнера с хемоаттрактантом. Ранее свойство E.faecalis нарушать миграцию отмечено в литературе в отношении макрофагов, нами впервые этот фактор патогенности установлен в отношении нейтрофилов. Направленная миграция к контейнеру с хемоаттрактантом характеризовалась либо малым (Proteus mirabilis 649-2), либо средним (Staphylococcus aureus 2879M) количеством высокоактивных клеток. Высокоразрешающая сканирующая ион-проводящая микроскопия (СИПМ) позволила выявить различия в миграции у «высокоактивных» и «низкоактивных» нейтрофилов, тогда как модуль Юнга всего нейтрофила не изменялся. Еще одной общей чертой была направленная миграция нейтрофилов по границе между эндотелиальными клетками. P.mirabilis 649-2 подавлял миграцию нейтрофилов, что было установлено по снижению количества активных клеток и более короткому расстоянию их миграции. Однако общий вектор миграции нейтрофилов был направлен в сторону контейнера с бактериями. Такая же стратегия наблюдалась и для S.aureus 2879M, но эффект был менее выраженным по сравнению с P.mirabilis 649-2. Помимо сагиттальной была реализована вертикальная модель трансэндотелиальной миграции, когда in vitro моделировался процесс септикопиемии. В этом случае общей чертой мигрирующих клеток было формирование крупной поры между эндотелиальными клетками, где впоследствии наблюдался процесс роения нейтрофилов. Помимо миграции в очагах, в отсутствии поры на близком расстоянии нейтрофил мог переползать на значительные расстояния для реализации миграции через уже открытые поры. Интересной особенностью явилось установление субпопуляционной вариабельности у нейтрофилов в процессе диапедеза. В частности, отдельные клетки могли переходить в состояние анергии и длительное время находиться на одном месте, не двигаясь. Подобные клетки были зафиксированы, при использовании разных бактериальных аттрактантов, например, E.coli 321 и S.aureus 2879М. Они имели характерную округлую морфологию, не обычную для активно-перемещающихся клеток, и находились в одной области в течение часового сканирования, не реагируя на зонд и любые другие внешние факторы. Еще одной интересной субпопуляцией клеток были нейтрофилы, которые, также не мигрируя в нижнюю камеру, формировали NETs на стресс-фибрилле эндотелиоцита. В модели септикопиемии методом высокоразрешающей СИПМ удалось выявить и многочисленные варианты альтерации эндотелиоцитов. Модельная септикопиемия приводила и к альтерации нейтрофилов, мигрировавших в нижнюю камеру: было установлено, что после реализации диапедеза они погибают по механизму NETs. Поскольку была зафиксирована альтерация эндотелиоцитов, дополнительно проводили исследование регенерационной способности эндотелия, подвергшегося воздействию бактерий. Было выявлено, что эндотелий хорошо регенерирует после повреждения как в отсутствие, так и в присутствии бактерий, а лучше всего регенерация происходила после альтерации грамотрицательными бактериями E. coli 321 и P. mirabilis 649-2. Было показано, что функциональную активность нейтрофилов можно оценить с помощью разработанного нами ранее метода регистрации осцилляции кантилевера атомно-силового микроскопа (АСМ). Ранее этот метод был разработан для экспресс-детекции антибиотикорезистентности разных штаммов бактерий. Аналитический сигнал DFL помог зарегистрировать и метаболическую активность непраймированного нейтрофила, и нейтрофила, активированного бактериями. Это очень интересный результат, поскольку благодаря оценке интенсивности нанодвижений, метод может помочь установить даже подпороговую перестройку метаболизма нейтрофилов. Определение продукции АФК эндотелиальными клетками было оценено амперометрическим методом. Было показано, что случайное касание нейтрофилом эндотелиальной клетки не приводит к активации последней и продукции ею АФК, тогда как при моделировании бактериемии как грамположительными, так и грамотрицательными бактериями наличие в системе одновременно и нейтрофилов и бактерий приводит к активации эндотелиальных клеток и гиперпродукции ими активных форм кислорода и азота. Была создана проточная модель, где над монослоем эндотелиоцитов создавался ток жидкости с нейтрофилами, имитирующий гемодинамический процесс. В экспериментах с использованием хемоаттрактантов большое количество клеток (1) отрывалось и переносилось потоком, (2) существенно изменяло морфологию при попытке противостоять току жидкости. При этом нужно отметить различные паттерны потери адгезии нейтрофилами при использовании разных хемоаттрактантов. В экспериментах с ускорением тока жидкости после 30 минут в большинстве случаев не менее половины всех нейтрофилов в области наблюдения постепенно теряла способность противостоять току жидкости, таким образом, количество адгезированных клеток сокращалось в два раза. Это объяснимо исчерпанием энергетических резервов отдельными клетками, уже начавшими функциональную перестройку. Таким образом, были выявлены особенности морфологии, вязко-упругих свойств клеток и их функциональной активности в моделях, имитирующих бактериемию (модель сагиттальной миграции) и септикопиемию (модель вертикальной миграции). Были выявлены сходные и различные паттерны миграционного процесса в зависимости от природы биохимических (TNFa, LTB4, LXA4) и бактериальных хемоаттрактантов (S.aureus 2879M. E.coli 321, P.mirabilis 649-2, E.faecalis 645-p2).

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В серии отработочных экспериментов была выработана модель на основе 20% желатина на котором выращивался монослой клеток линии EA.hy 962, имитирующий tunica intima и tunica media сосудов. Эта модель (1) сохраняла проницаемость для нейтрофилов, (2) позволяла вести длительные оптические наблюдения благодаря полупрозрачности. В горизонтальной модели было отмечено два типа миграции нейтрофилов: миграция единичных клеток и миграция роев нейтрофилов. Меньшая часть клеток продолжила миграцию по градиенту хемоаттрактации, тогда как большая часть сформировала рой с внешней стороны «сосуда», который им удалось преодолеть. Оценка жизнеспособности этих клеток показала, что в случае прохождения барьера в отсек без хемоаттрактанта (контроль) выживаемость нейтрофилов порядка 50%, а в случае миграции в отсек с бактериями (S.aureus) она статистически значимо снижалась до 20%. Подавляющее число мигрирующих клеток погибло по механизму апоптоза. В сверхплановой большой серии экспериментов удалось зафиксировать обратную миграцию нейтрофилов в «сосуд». Методом высокоразрешающей СИПМ постадийно процесс обратной миграции продемонстрирован нами впервые в мире. В процессе миграции нейтрофилов морфометрические и вязко-упругие свойства эндотелиальных клеток менялись незначительно. Использование для исследования FITC-альбумина в качестве трейсера показало, что в отсутствие нейтрофилов проницаемость эндотелиального слоя в присутствие хемоаттрактантов не отличается статистически значимо от контроля. Провели количественную оценку АФК-продукции в процессе миграции. Для нейтрофилов на пластике была характерна гиперпродукция АФК в отсутствие хемоаттрактанта, когда нейтрофилы максимально реализовывали стратегию адгезии к субстрату. Через 30 мин продукция АФК в контроле (без градиента) начинала превосходить продукцию мигрирующих по градиенту хемоаттрактации нейтрофилов, достигая максимума к окончанию 60 мин интервала и статистически значимо превосходя все экспериментальные группы. В случае внесения хемоаттрактанта (как бактериального, так и биохимического) у нейтрофилов, находящихся на поверхности пластика, появлялась потенция к миграции и падала АФК-продуцирующая активность. Абсолютно противоположная картина наблюдалась в случае использования в качестве подложки для нейтрофилов культуры клеток ЕА.hy926 (в остальном ход эксперимента не изменялся): в экспериментах с эндотелиальным монослоем контроль был статистически значимо ниже всех экспериментальных групп на протяжении эксперимента за исключением группы, где в качестве хемоаттрактанта использовался P.mirabilis. Кроме того, общая продукция АФК у нейтрофилов при стимуляции целым рядом хемоаттрактантов оказалась статистически значимо ниже в случае миграции клеток по поверхности эндотелиальных клеток. Таким образом, у нейтрофилов выше потенция к миграции при использовании монослоя эндотелиоцитов, имитирующих поверхность сосудов, при этом адгезионный потенциал снижается параллельно со снижением АФК-продукции. Важно помнить, что АФК выступают не только в качестве деструктивного агента в процессе реализации кислородного взрыва и киллинга микроорганизмов, они выполняют и регуляторную функцию. По всей вероятности, степень АФК-продукции нейтрофилов во многом определяется тем, какая (бактерицидная, регуляторная, адгезионная и т.д.) функция превалирует у нейтрофила в данный момент. Эта идея подтверждается в серии экспериментов с использованием уникальной методики амперометрического анализа, который был реализован в ходе совместных экспериментов, проведенных на базе ОИ. Была исследована АФК-продукция единичной клетки и ее изменение во времени благодаря наноинвазивной методике введения платинового нанокапилляра внутрь клетки и записи хроноамперограммы. Была разработана новая техника забора нейтрофила с поверхности и ее контакта с эндотелиальной клеткой. Впервые в мире был получен результат, что непраймированный нейтрофил (контроль, не взаимодействующий с хемоаттрактантами) при взаимодействии с поверхностью эндотелиальной клетки не отвечал активационным сигналом, тогда как праймированный нейтрофил (прединкубированный со S.aureus либо с E.coli) отвечал выраженной АФК-продукцией. Результаты, полученные на единичных клетках полностью коррелируют с результатами измерения АФК-продукции пула нейтрофилов. Помимо корреляции между адгезией и АФК-продуцирующей активностью нейтрофилов выявлена еще одна связь: нейтрофилы, адгезированные на бесклеточной поверхности тратят больше энергии по сравнению с нейтрофилами, мигрирующими по поверхности эндотелиальных клеток. Такая зависимость наблюдалась при использовании всех видов хемоаттрактантов. То есть, на адгезионные процессы, требующие перестройки цитоскелета и активации АФК-продуцирующего потенциала нейтрофилы тратят намного больше энергии, чем на миграцию по поверхности эндотелиальных клеток, сопровождающуюся намного менее выраженной продукцией АФК. Кроме того, на поверхности пластика часто наблюдали не только расход энергии клетками (подсчет СЦК велся только по клеткам, сохранившим целостность), но и гибель клеток в результате воздействия хемоаттрактанта. В отличие от миграции через барьер, где нами установлена клеточная гибель преимущественно по механизму апоптоза, в случае адгезии на пластике преобладало образование внеклеточных ловушек (NETs), особенно под воздействием S.aureus. Были проведены эксперименты по исследованию миграции нейтрофилов по поверхности эндотелиальных клеток по градиенту хемоаттрактации, создаваемому сочетанием хемоаттрактантов: один штамм бактерий + один биохимический агент. Было обнаружено, что комплексное влияние хемоаттрактантов существенно отличается от воздействия единичного хемоаттрактанта, что проявляется не только в увеличении числа высокоактивных клеток и длине пути, пройденного нейтрофилами, но и, в некоторых случаях, даже в смене направления миграции клеток. Интенсивность АФК-образования при использовании комплекса хемоаттрактантов также существенно увеличивалась. В целом бактерии больше необходимы для направленной миграции нейтрофилов, а биохимические факторы больше проявляют стимулирующий характер. Поскольку переползание нейтрофилов происходит в условиях динамического сдвига (тока крови) мы смоделировали динамическую систему с током жидкости, которая эквивалентна току крови в венулах. После миграции нейтрофилов в таких условиях в присутствие хемоаттрактанта наблюдали увеличение экспрессии интегриновых рецепторов нейтрофилов (CD11a, CD11b, CD18), однако для идентификации рецепторов потребовалось применение ингибиторов протеаз. Помимо мембран-связанных форм рецепторов были идентифицированы также растворимые формы интегринов.