КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 23-64-00002
НазваниеРазработка инструментов для генотерапий. Новые подходы к оптимизации структуры трансгена, векторов доставки, патологических моделей.
Руководитель Волчков Павел Юрьевич, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" , г Москва
Конкурс №83 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-207 - Системная биология; биоинформатика
Ключевые слова генотерапии, РНК секвенирование единичных клеток, кодоноптимизация, органоиды, синтетические промоторы, ретинопатии, кора надпочечников, ААВ векторы
Код ГРНТИ34.15.27
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Проект направлен на разработку подходов к повышению эффективности генотерапий. Генотерапии получают все большее распространение. На данный момент в мире зарегистрировано всего два препарата для in vivo генотерапии наследственных заболеваний, однако уже в 2020 году на стадии клинических испытаний находилось около 1500 препаратов для генотерапий различных заболеваний. Зачастую используемые подходы при разработке этого класса препаратов недостаточно эффективны, что обусловлено невысокой эффективностью доставки препарата, отсутствием тканеспецифичности доставляемой экспрессионной кассеты. Также остро стоит вопрос создания адекватных патологических моделей для proof-of-concept экспериментов и доклинических исследований.
Проект предлагает комплексный подход к проблеме и направлен на решение следующих задач:
-создание тканеспецифичных синтетических промоторов на основе анализа данных секвенирования мРНК единичных клеток различных тканей, в том числе коры надпочечников и сетчатки глаза
-создание подходов к тканевой кодоноптимизации на основе анализа данных секвенирования мРНК единичных клеток различных тканей, в том числе коры надпочечников и сетчатки глаза
-создание ткане/органоподобных патологических клеточных моделей путем направленной дифференцировки ИПСК, полученных от больных наследственными орфанными заболеваниям, в том числе ретинопатиями
-создание новых векторов доставки на основе РНК вирусов
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Публикации
1. Gene Therapy Approaches for the Treatment of Hemophilia B (год публикации - 2023)
2.
Сорока А.Б., Феоктистова С.Г., Митяева О.Н., Волчков П.Ю.
Gene Therapy Approaches for the Treatment of Hemophilia B
International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 10766 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms241310766
Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На втором этапе работ на основании обработки данных одноклеточного секвенирования РНК были выбраны по 500 генов максимально специфических для продуцирующих стероидные гормоны клеток коры надпочечников и фоторецепторов сетчатки. Из этого списка были выбраны наиболее специфичные и имеющие высокую экспрессию гены. Промоторные области выбранных генов были использованы для конструирования промоторов-кандидатов для дальнейшего тестирования их эффективности и специфичности.
Кроме этого, на основании данных одноклеточного секвенирования, а также данных о стабильности РНК был предложен алгоритм кодоноптимизации последовательностей мРНК, были получены оптимизированные для коры надпочечников и фоторецепторов сетчатки последовательности зеленого флуоресцентного белка для дальнейшей оценки их эффективности.
В части работ по получению модельных объектов наследственных заболеваний были получены органоиды из иПСК доноров со здоровой сетчаткой. На полученных органоидах отработаны тесты для получения молекулярных и функциональных характеристик сетчаточных органоидов. Отработан протокол определения типов клеток в полученных органоидах методом проточной цитометрии, протокол ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени для оценки уровня экспрессии генов характерных для разных типов клеток сетчатки. Отработан метод patch clamp для анализа свойств ионных каналов отдельных клеток (фоторецептор подобных клеток) органоидов.
В части работ по разработке векторных систем доставки был собран и охарактеризован модельный вирусный вектор, несущий репортерный ген зеленого флуоресцентного белка на основе вируса гриппа.
Публикации
1.
Алсаллум А., Мосин И., Шефер К.К., Мингалева Н.С., Ким А.Р., Малюгин Б., Бойко E., Феоктистова С.Г., Султанов Ш.Р., Митяева О.Н., Волчков П.Ю.
Novel and Previously Known Mutations of the KCNV2 Gene Cause Various Variants of the Clinical Course of Cone Dystrophy with Supernormal Rod Response in Children
Journal of Clinical Medicine, Journal of Clinical Medicine, том 13, издание 16, страницы 4592 (год публикации - 2024)
10.3390/jcm13164592
2.
Артемьев В.В, Губаева А.С., Паремская А.Ю., Джиоева А.А., Девяткин А.А., Феоктистова С.Г., Митяева О.Н., Волчков П.Ю.
Synthetic Promoters in Gene Therapy: Design Approaches, Features and Applications
https://www.mdpi.com/journal/cells, Cells 2024, 13(23), 1963; https://doi.org/10.3390/cells13231963 (год публикации - 2024)
doi.org/10.3390/cells13231963
3.
Онянов Н.А., Глазова О.В., Сакр Н., Крокунова Т.Е., Крупинова Ю.А., Волчков П.Ю.
Alternative Ways to Obtain Human Mesenchymal Stem Cells from Embryonic Stem Cells
Cells , Cells 2024, 13(19), 1617; https://doi.org/10.3390/cells13191617 (год публикации - 2024)
doi.org/10.3390/cells13191617
4.
Алсаллум А., Горносталь Е.А., Мингалева Н.С., Павлов Р.Е., Кузнецова Е.А., Антонова Е.Н., Наджафова А.Р., Колотова Д., Кадышев В., Митяева О.Н., Волчков П.Ю.
A Comparative Analysis of Models for AAV-Mediated Gene Therapy for Inherited Retinal Diseases
Cells, Cells 2024, 13(20), 1706; https://doi.org/10.3390/cells13201706 (год публикации - 2024)
doi.org/10.3390/cells13201706
5.
Ширягин В.В., Девяткин А.А., Фатеев О.Д., Петряйкина Е.С., Богданов В.П., Антышева З.Г., Волчков П.Ю., Юдин С.М., Воронцова М., Скворцова В.И.
Genomic complexity and clinical significance of the RCCX locus
Peerj, 10.7717/peerj.18243 (год публикации - 2024)
10.7717/peerj.18243
6.
Дашьян М.А., Вольхин И.А., Волчков П .Ю., Девяткин А.А.
Genotypic differentiation and evolutionary dynamics of puumala orthohantavirus (PUUV)
Acta Virologica, Volume 68 - 2024 | https://doi.org/10.3389/av.2024.13168 (год публикации - 2024)
10.1128/mra.00312-24
7.
Алсаллум А., Шефер К.К., Богданов П.П., Мингалева Н.С., Феоктистова С.Г., Митяева О.Н., Волчков П.Ю.
Establishment of a human induced pluripotent stem cell line (ABi004-A) carrying a compound heterozygous mutation in the KCNV2 gene
Stem Cell Research, Stem Cell Research
Volume 80, October 2024, 103512 (год публикации - 2024)
10.1016/j.scr.2024.103512
8.
Паремская А.Ю., Коган А.А., Мурашкина А.А, Наумова Д.А., Сатиш А., Абрамов И.С., Феоктистова С.Г. , Митяева О.Н, Девяткин А.А., Волчков П.Ю.
Codon-optimization in gene therapy: promises, prospects and challenges
Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, Volume 12 - 2024 | https://doi.org/10.3389/fbioe.2024.1371596 (год публикации - 2024)
doi.org/10.3389/fbioe.2024.1371596
9.
Горносталь Е.А., Алсаллум А., Митяева О.Н., Волчков П.Ю.
Generation of induced pluripotent stem line (MIPTi001-A) derived from patient with X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD)
Stem Cell Research, Stem Cell Research, Volume 74, February 2024, 103298 (год публикации - 2024)
doi.org/10.1016/j.scr.2023.103298
10. Максимов Д.О., Наумова Д.А., Астахова Е.А., Артемьев В.В., Бирюков С.А., Абрамов И.С., Навойкова А.А., Рудев Н.В., Феоктистова С.Г., Глазова О.В.,Митяева О.Н., Волчков П.Ю. Оценка тропизма и биораспределения синтетических и природных аденоассоциированных вирусных векторов in vivo методом секвенирования нового поколения БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение, 2024;24(2):215-228. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-2-215-228 (год публикации - 2024)
Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Задача 1.
Наработаны и заклонированы upstream-участки тканеспецифичных генов в качестве альтернативы синтетическим промоторам. Для большинства генов выбраны фрагменты длиной до 2000 п.н., а для отдельных, включая KCNV2, наработано несколько вариантов upstream-областей различной длины. Полученные конструкции с целевыми участками заклонированы в трансферные баркодированные плазмиды, на их основе собрана библиотека AAV-векторов с разнообразными промоторными вариантами. Готовые AAV-векторы получены в достаточном качестве и количестве для проведения дальнейшего анализа их экспрессии в моделях надпочечников и сетчатки.
Задача 2.
Выполнена сборка библиотеки кодон-оптимизированных последовательностей трансгенов для экспериментальной оценки тканеспецифичной экспрессии. Получены пять вариантов конструкций для сетчатки и 5 вариантов конструкций для коры надпочечников. На их основе создана библиотека трансферных плазмид, содержащих кодон-оптимизированные трансгены в плазмидах с конститутивным промотором и ITR-последовательностями для последущей сборки ААВ векторов.
Задача 3.
Выполнена успешная генерация и комплексная характеристика органоидов сетчатки, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с колбочковой дистрофией, связанной с мутациями в гене KCNV2. Разработан воспроизводимый протокол дифференцировки, обеспечивающий формирование трехмерных органоидов, включающих все ключевые клеточные типы сетчатки: фоторецепторы, биполярные, горизонтальные, амакриновые, ганглионарные клетки и пигментный эпителий. Морфологический и иммуногистохимический анализ подтвердил правильную стратификацию и экспрессию маркеров созревания, таких как rhodopsin, recoverin и PKCα.
Выявлена корреляция между генотипом и фенотипом органоидов: при гетерозиготной мутации KCNV2 экспрессия белка сохранялась, формирование функциональных фоторецепторов происходило нормально; органоиды с компаунд-гетерозиготными мутациями демонстрировали полное отсутствие KCNV2, что объясняет тяжёлые функциональные нарушения; органоиды второго пациента с иной комбинацией мутаций сохраняли сниженный, но детектируемый уровень экспрессии.
Функциональная оценка методом patch-clamp показала, что фоторецептороподобные клетки генерируют преимущественно не-спайковые ответы, отличные от классических нейронных, при этом органоиды с компаунд-гетерозиготными мутациями демонстрировали статистически значимое снижение амплитуды токовых ответов, указывая на нарушение формирования функциональных калиевых каналов.
Задача 4.
Созданы три варианта мутантных вирусных векторов с температурочувствительными точечными изменениями в генах полимеразного комплекса. Внесенные мутации подтверждены секвенированием; соответствующие плазмиды были использованы для сборки вирусных векторов.
Оценка репликативной активности показала, что при пермиссивной температуре все варианты сохраняют нормальный уровень репликации, тогда как при повышенной температуре один вариант продемонстрировал выраженное снижение репликативной активности. Этот вариант выбран как оптимальный кандидат для разработки ослабленного вирусного вектора. На его основе создан вектор с включением гена флуоресцентного белка в NS-сегмент.
Публикации
1.
Боброва Н.А., Лисененкова Е.Д., Авсиевич Е.С., Митяева О.Н., Волчков П.Ю., Девяткин А.А.
Reassortment Dynamics: Phylogeography and Evolution of H4N9 Influenza Viruses
Pathogens, Pathogens. 2025 May 12;14(5):469 (год публикации - 2025)
10.3390/pathogens14050469
2.
Наумова Д.А., Крокунова Т.Е., Максимов Д.О., Митяева О.Н., Астахова Е.А., Волчков П.Ю.
Challenges in Humoral Immune Response to Adeno-Associated Viruses Determination
International Journal of Molecular Sciences, Int J Mol Sci. 2025 Jan 19;26(2):816. (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26020816
3.
Боброва Н.А., Любимова Д.И., Мишина Д.М., Лобанова В.С., Валиева С.И., Митяева О.Н., Феоктистова С.Г., Волчков П.Ю.
Experimental Animal Models of Phenylketonuria: Pros and Cons
International Journal of Molecular Sciences, Int J Mol Sci. 2025 May 30;26(11):5262 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26115262
4.
Марьянчик С.В., Боровикова С.Е., Иванова А.О., Трофимов В.В., Багрова О.Е., Фролова А.С., Митяева О.Н., Волчков П.Ю., Девяткин А.А.
Antivirotics based on defective interfering particles: emerging concepts and challenges
Front. Cell. Infect. Microbiol., Sec. Veterinary and Zoonotic Infection
Volume 15 - 2025 (год публикации - 2025)
10.3389/fcimb.2025.1436026
5.
Вольхин И.А., Паремская А.Ю., Дашьян М.А., Смешнова Д.С., Павлов Р.Е., Митяева О.Н., Волчков П.Ю., Девяткин А.А.
Selection of UTRs in mRNA-Based Gene Therapy and Vaccines
Biochemistry (Mosc), ISSN 0006-2979, Biochemistry (Moscow), 2025, Vol. 90, No. 6, pp. 725-753 © Pleiades Publishing, Ltd., 2025.Published in Russian in Biokhimiya, 2025, Vol. 90, No. 6, pp. 781-811. (год публикации - 2025)
10.1134/S0006297924604659
6.
Астахова Е.А., Губаева А.С., Наумова Д.А, Егорова А.Е., Мазнина А.А., Рыбкина И.Г., Османов И.М., Табаков Д.В., Митяева О.Н., Волчков П.Ю.
Spectral Flow Cytometry: The Current State and Future of the Technology
International Journal of Molecular Sciences, Int J Mol Sci. 2025 Jun 19;26(12):5911. (год публикации - 2025)
10.3390/ijms26125911
7.
Горносталь Е.А., Алсаллум А., Дегтярев Е.П., Кузнецова Е.С., Левашова А.Р., Мишина Д.М., Мингалева Н.С., Мазлум А., Богданов В.П., Крупинова Ю.А., Михалков С., Рыбкина И., Митяева О.Н., Волчков П.Ю.
An AAV-Based Therapy Approach for Neurological Phenotypes of X-Linked Adrenoleukodystrophy
International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2025, 26(23), 11645 (год публикации - 2025)
10.3390/ijms262311645