Фазовые переходы каркасных белков стресс-гранул при патологическом и естественном старении

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-45-00041

НазваниеФазовые переходы каркасных белков стресс-гранул при патологическом и естественном старении

Руководитель Фонин Александр Владимирович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук , г Санкт-Петербург

Конкурс №74 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (NSFC)

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова немембранные органеллы, фазовое разделение жидкость - жидкость, стресс-гранулы, нейродегенеративные заболевания, амилодные фибриллы, старение, внутренне неупорядоченные белки

Код ГРНТИ34.15.43

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В последние годы, вследствие улучшения качества жизни, в развитых странах существенно возросла продолжительность жизни людей, однако это привело также к тому, что ранее редко встречающиеся заболевания, характерные для лиц преклонного возраста, в том числе нейродегенеративные болезни и т.д. стали приобретать характер эпидемии. В связи с этим высокую актуальность приобрели исследования, направленные на разработку подходов для снижения негативных эффектов патологического старения и замедления процессов естественного старения. Молекулярными аспектами старения являются нарушение протеостаза, дерегуляция внутриклеточных сигнальных путей, обилие в клетке неправильно свернутых белков. Согласно современным представлениям, регуляция большинства клеточных процессов на молекулярном уровне осуществляется при участии немембранных органелл – динамических образований, возникающих в результате фазового разделения «жидкость – жидкость» биополимеров. В связи с этим, в рамках выполнения Проекта планируется, комбинируя подходы in vitro and in cellulo, определить роль фазовых переходов каркасного белков стресс-гранул G3BP1 и шаперона SERF способного регулировать жидко-каплеьные свойства немембранных органелл, а также выяснить механизмы функционирования и структуры этих органелл при нормальном функционировании клетки, при естественном и патологическом старении, а также определить факторы, регулирующие изменение активности и структуры стресс-гранул в этих условиях. Эти компартменты, появляющиеся в клетке в ответ на стрессовое воздействие и исчезающие после прекращения этого воздействия, непосредственно вовлечены в регуляцию стресс-ответа. Кроме того, протекание ряда нейродегенеративных заболеваний сопровождается трансформацией этих немембранных органелл в амилоидные фибриллы. Особое внимание в рамках выполнения проекта будет уделено изучению роли ассоциации стресс-гранул с цитоскелетом и образования каркасными белками этих органелл жидко-капельных структур на поверхности мембран в процессах патологического и естественного старения. Комбинация подходов in vitro и in cellulo позволит получить подробную информацию о формировании, функционировании и структуре немембранных органелл на примере стресс-гранул, их роли в поддержании клеткой жизнеспособности при нормальных, стрессовых и патологических условиях. Эти данные будут иметь не только существенное фундаментальное значение, но и могут быть использованы при разработке препаратов, направленных на подавление последствий острых и хронических стрессовых нагрузок, а также процессов старения.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Мануйлов В.Д., Ильинский Н.С., Нестеров С.В., Сакр Б.М.Г.А., Дэйхофф Г.В., Зиновьев Е.В., Матренок С.С., Фонин А.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Иванович В., Уверский В.Н. Chaotic aging: intrinsically disordered proteins in aging-related processes Cellular and Molecular Life Sciences, 80(9), 269 (год публикации - 2023)
10.1007/s00018-023-04897-3

2. Сакр Б.М.Г.А., Котоянц Н.О., Нестеров С.В., Мануйлов В.Д., Дэйхофф Г.В., Фонин А.В., Туроверов К.К., Кузнецова И.М., Горделий В.И., Ильинский Н.С., Уверский В.Н. Ageing drop by drop: Disturbance of the membrane-less organelle biogenesis as an aging hallmark Biochemical and Biophysical Research Communications, 742, 151088 (год публикации - 2025)
10.1016/j.bbrc.2024.151088

3. Мокин Я.И., Ильинский Н.С., Нестеров С.В., Смирнов Е.Ю., Сергеева О.С., Романович А.Е., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Уверский В.Н., Фонин А.В. Stress-granules, P-bodies, and cell aging: A bioinformatics study Biochemical and Biophysical Research Communications, 694, 149404 (год публикации - 2024)
10.1016/j.bbrc.2023.149404

4. Силонов С.А., Нестеров С.В., Гаврилова А.А., Сергеева О.С., Романович А.Е., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Фонин А.В. Time-resolved fluorescence of ANS dye as a sensor of proteins LLPS Biochemical and Biophysical Research Communications, 151164 (год публикации - 2025)
10.1016/j.bbrc.2024.151164

5. Сергеева О.С., Неклесова М.В., Реушев В.А., Артемов А.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Уверский В.Н., Фонин А.В. On the potential roles of TDP-43 in the formation of membraneless organelles and their transformation into toxic aggregates Biochemical and Biophysical Research Communications, 788:152808 (год публикации - 2025)
10.1016/j.bbrc.2025.152808

6. Силонов С.А., Куклин А.И.,Нестеров С.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Фонин А.В. Pitfalls of Using ANS Dye Under Molecular Crowding Conditions International Journal of Molecular Sciences, 25(24), 13600 (год публикации - 2024)
10.3390/ijms252413600

7. Нестеров С.В., Ильинский Н.С., Фонин А.В., Уверский В.Н. Signal Transduction by Phase Separation-Unnoticed Revolution in Molecular Biology Journal of Molecular Recognition , 38(2):e70003 (год публикации - 2025)
10.1002/jmr.70003

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
отчетный период были продолжены структурно-динамические исследования фазового разделения G3BP1 in vitro и cellulo при различных внешних условиях. Установлено, что при РНК-индуцированном фазовом разделении G3BP1 не изменяется вторичная структура белка, однако наблюдается уменьшение вклада тирозиновой флуоресценции в суммарную УФ-флуоресценцию G3BP1. При этом время-разрешенные зависимости анизотропии триптофановой флуоресценции зависят от РНК-индуцированного LLPS G3BP1. Это согласуется с известными данными о «расплетании» структуры внутренне неупорядоченных белков при их фазовом разделении. Показано тушение как стационарных, так время-разрешенных характеристик триптофановой фосфоресценции G3BP1 при фазовом разделении этого белка. Полученные данные позволяют предположить, что при фазовом разделении наблюдается сближение Trp 251, локализованного в IDR-2, слабоположительно заряженном неупорядоченном регуляторном домене G3BP1 и Cys 73, локализованного в упорядоченном димеризационном NTF2-подобном домене на расстояние менее 1 нм. Охарактеризовано влияние ионов двухвалентных металлов, каркасных белков стресс-гранул, фосфатов на структурно-динамические свойства G3BP1 с использованием широкого диапазона методов. Установлено, что АТФ и ГТФ оказывают существенно различное влияние на характеристики G3BP1. По-видимому, АТФ способствует компактизации структуры белка. Хлориды кальция, магния и марганца практически не оказывают влияния на структуру G3BP1 и его фазовое разделение. Действие хлорида цинка на G3BP1 радикально отличается от действия солей других двухвалентных металлов. Наблюдается агрегация G3BP1 с выпадением визуально заметного осадка. Такое же действие на G3BP1 оказывают комплексы исследуемых ионов двухвалентных металлов с АТФ. Показано, что ZnCl2, помимо агрегации, увеличивает стабильность G3BP1, а комплекс G3BP1 c C-концевым доменом TDP-43 как суперпозиция этих двух белков, а не как единое структурное образование. С использованием ЯМР-спектроскопии установлено добавление RNA и ATФ вызывает ассоциацию глобулярных доменов G3BP1 и образованию комплексов с последовательной перестройкой локальной конформации подвижных IDP-участков. Более того, из анализа 1H-ЯМР спектров комплекс G3BP1/RNA/ATP устойчив, но в присутствии катионов Mg2+ данные перестройки усиливаются, и в результате, по-видимому, «включается» хеликазная активность комплекса G3BP1/RNA/ATФ с трансформацией ATФ в AMФ (AДФ). При этом добавление Zn2+ вызывает ассоциацию глобулярных доменов G3BP1, и дополнительно Zn2+ координирует, по-видимому, подвижные IDP-участки G3BP1 (предположительно His-насыщенные и с амидными группами с быстрым обменом с водой) в некие структуры, значительно менее доступные молекулам воды. Полученные результаты были дополнены исследованиями с использованием малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS). Установлено, что молекулы ZnCl2 вызывают агрегацию G3BP1, а АТФ способствует приобретению белком более «открытой» конформации. Охарактеризована возможность использования флуоресцентного красителя АНС для визуализации конденсатов, образуемых G3BP1. С использованием флуоресцентной микроскопии с временным разрешением (FLIM) показано, что АНС способен накапливаться в РНК-индуцированных конденсатах G3BP1 в водных растворах, но не конденсатах G3BP1, образуемых этим белком в условиях макромолекулярного краудинга, создаваемого в высококонцентрированных растворах PEG. По материалам этих экспериментов опубликована статья в журнале BBRC. Также исследовано изменение флуоресцентных характеристик АНС в растворах различных краудинг-агентов, способных индуцировать фазовое разделение внутренне неупорядоченных белков. По материалам этих экспериментов подготовлена и направлена в журнал IJMS статья “ Pitfalls of using ANS dye under molecular crowding conditions”, прошедшая рецензирование и получившая положительные отзывы. В бактериальных экспрессионных системах были получены препараты белков TDP-43, hNRNPA1 и TIA-1, в том числе их мутантные формы, характерные для нейродегенеративных заболеваний. С использованием динамического светорассеяния исследована трансформация конденсатов С-концевого домена TDP-43 при различных внешних условиях. С использованием аналитической гель-фильтрации охарактеризованы комплексы G3BP1 c С-концевым доменом G3BP1. Установлено формирование этими белками неких промежуточных структур с молекулярной массой около 40 кДа. Начаты совместные с китайскими партнерами работы по изучению влияния белка SERF на фазовое разделение G3BP1 при различных внешних условиях. Выполнен пул клеточных работ по влиянию экспрессии SERF на структурно-динамические характеристики стресс-гранул в клетках иммортализованных и первичных дермальных фибробластов, в том числе полученных от пациентов с редкими наследственными заболеваниями (атаксия-телеангиэктазия и синдром Коккейна), характеризующихся ускоренным старением. Выполнен масс-спектрометрический анализ протеома таких клеток в пролиферативном и сенесцентном состояниях. Предварительно установлено существенное снижение относительного содержания белков, участвующих в процессах сплайсинга. Выполнен биоинформатический анализ вовлеченности различных немембранных органелл, в том числе стресс-гранул, в процессы репликативного и биологического старения. Полученные результаты опубликованы в двух статьях в журнале BBRC

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году были охарактеризованы структурно-динамических свойств G3BP1 при его разделении на фазы в различных внешних условиях. Были разработаны и созданы генетические конструкции, обеспечивающие экспрессию и получение различных мутантных форм G3BP1, включая отдельные домены этого белка, а также мутантные формы, обеспечивающие «картирование» G3BP1 с использованием флуоресцентной спектроскопии. Согласно разрабатываемой нами модели фазового разделения G3BP1, РНК-индуцированный переход этого белка в жидко-капельную фазу обусловлен его конформационными изменениями вследствие неспецифических взаимодействий между С-концевыми (RRM и IDR3) доменами G3BP1 и РНК. Эти взаимодействия имеют электростатическую природу. Так как фазовое разделение вызывает еще большее уширение детектируемых сигналов, то было принято решение моделировать конфомационные изменения G3BP1 при его LLPS. Для этого были зарегистрированы спектры ЯМР G3BP1 в концентрированных растворах NaCl, так как неспецифические взаимодействия между IDR3 доменом G3BP1 и отрицательно заряженными ионами хлора вызывают конформационные изменения G3BP1, сходные с РНК-индуцированными. Введение в раствор G3BP1 450 мМ NaCl вызвало появление множество новых, хорошо диспергированных сигналов. Их положение и паттерн оказались близки к сигналам изолированного RRM-домена. По-видимому, введение в исследуемые растворы высокой концентрации соли ослабляет эт, взаимодействия электростатической природы. В результате RRM-домен приобретает большую сегментарную подвижность относительно остальной части белка, его эффективное τc уменьшается, скорость релаксации R2 падает, и соответственно его сигналы становятся видимыми в спектре. Данный эффект является прямым доказательством существования в белке G3BP1 внутримолекулярных взаимодействий, опосредованных зарядами, которые могут модулировать доступность и динамику глобулярных доменов. Полученные результаты были подтверждены данными флуоресцентной спектроскопии в стационарном и время-разрешенном вариантах. Использование пула мутантных форм G3BP1, содержащих единственный триптофановый остаток в различных доменах белка, позволило дополнить данные о конформационных изменений G3BP1. В частности, было показано увеличение подвижности неупорядоченных доменов G3BP1 как при РНК-индуцированном фазовом разделении этого белка, так и в растворах с высокой ионной силой. Также, с использованием синхротронного оборудования в Шанхае, был выполнен большой пул экспериментов по анализу кривых малоуглового рассеяния рентгеновских лучей на образцах G3BP1 при различных внешних условиях. Установлено, что увеличение ионной силы раствора приводит к увеличению радиуса инерции (Rg) полноразмерного G3BP1. Сопоставление полученных данным с результатами ЯМР-спектроскопии позволяет увеличить разрешение для этой модели: мы непосредственно наблюдаем, как высокая ионная сила «высвобождает» RRM-домен, делая его видимым, что коррелирует с увеличения Rg. Таким образом, функционально важные глобулярные домены в составе полноразмерного G3BP1 находятся в динамическом равновесии между «скрытым» (вовлеченным в контакты) и «свободным» состояниями, и это равновесие может регулироваться электростатическими условиями в клетке, например, локальными изменениями ионной силы или концентрацией связывающих партнеров. Установлено, что трифосфаты, помимо агрегации белка в отсутствие РНК, способствуют стабилизации РНК-индуцированных конденсатов G3BP1. Показано, что мутантные формы белков TDP-43, hNRNPA1 и TIA-1, характерные для нейродегенеративных заболеваний, способствуют агрегации G3BP1 и отвердеванию РНК-индуцированных конденсатов этого белка. В то время как SERF способствует диссоциации стресс-гранул и увеличению их динамичности, а также динамичности конденсатов G3BP1. Показано, что ионы двухвалентных металлов связываются исключительно с димерной формой G3BP1. В рамках выполнения запланированных клеточных работ, были охарактеризованы динамические свойства стресс-гранул при включении в их состав мутантных форм белков TDP-43, hNRNPA1 и TIA-1. Показано, что включение в состав стресс-гранул анализируемых белков вызывал увеличение времени восстановления флуоресценции EGFP-G3BP1 после фотообесцвечивания, т.е. вызывало замедление динамики обмена G3BP1 с цитоплазмой – отвердевание стресс-гранул. Наиболее интересные результаты были получены при анализе коэкспрессии G3BP1 и С-концевого домена TDP-43 в исследуемых клетках. Установлено, что в отличие от полноразмерного TDP-43, коэкспрессия G3BP1 с С-концевым доменом TDP-43 вызывало транслокацию G3BP1 в ядро исследуемых клеток с образованием малодинамичных структур. Также в 2025 году был проанализирован изменение протеомного состава исследуемых клеток дермальных фибробластов, полученных как от здоровых доноров разного возраста, так и от пациентов с болезнями, характеризующимися ускоренным старением, синдромом Коккейна и атаксией-телеангиэктазией при переходе исследуемых клеток в сенесцентное состояние. Выполненный масс-спектрометрический анализ позволил идентифицировать кластеры генов, чья экспрессия существенно изменялась при переходе анализируемых клеток сенесцентное состояние. Установлено, что экспрессия ряда белков менялась у всех анализируемых клеток. Так, белки NEK1, LRRC45, LIMS2, PPFIBP1, ZNF703, SEMA3D, ANKRD10 формируют кластер, вовлеченный в регуляцию механосенсинга, систему цитоскелета, связь клеток с внеклеточным матриксом, адгезиии миграции клеток. Другая группа регулирует рост на ином уровне – участвует в секреции факторов роста, цитокинов и компонентов внеклеточного матрикса ограничивает пролиферацию – это белки IRAG1, INHBA, STX3. SLC38A1 и ATPAF1 можно отнести не к сигнально-регуляторным, а к чисто вспомогательным метаболически значимым белкам, нужным для обеспечения процессов роста – осуществляют транспорт (SLC38A1, траспортёр глутамата) и утилизацию (ATPAF1 компонент АТФ-синтазы) питательных веществ. При этом в клетках, полученных от молодых здоровых доноров наблюдается увеличение экспрессии анализируемых белков, а в клетках, полученных от больных пациентов –снижение.

Публикации