Конформационная динамика в образовании и функционировании биомакромолекулярных комплексов для биомедицинских и фармацевтических разработок

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-44-10021

НазваниеКонформационная динамика в образовании и функционировании биомакромолекулярных комплексов для биомедицинских и фармацевтических разработок

Руководитель Бочаров Эдуард Валерьевич, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук , г Москва

Конкурс №73 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (БРФФИ)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые слова Интегративная структурная биология, спектроскопия ЯМР, малоугловое рентгеновское рассеяние, рентгеноструктурный анализ, атомно-силовая микроскопия, молекулярное моделирование, молекулярная динамика, биомакромолекулярные комплексы, конформационная динамика, нуклеоид-ассоциированные белки, цитохром P450, стеблевой комплекс рибосомы, аллостерическая регуляция

Код ГРНТИ34.15.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Функционирование белков, как основных структурных и функциональных единиц клетки, неразрывно связано с формированием и распадом макромолекулярных комплексов, которое является ответом на изменение внешней или внутренней (мутации) среды и ассоциировано с изменением конформации молекул. Поэтому для изучения макромолекулярных взаимодействий в белоксодержащих комплексах требуются не только знание статической структуры белка, но и данные о конформационной динамике. Наиболее сложной задачей является изучение структуры и динамики белков, которые содержат мало-структурированные подвижные участки, которые принято называть внутренне-неупорядоченными (IDP – intrinsic disordered protein). Такие участки облегчают конформационные перестройки белков, связанные изменением условий или взаимодействием с другими макромолекулами, и их количество увеличивается в ряду бактерии – археи – эукариоты. Проект направлен на изучение фундаментальных основ образования и стабильности макромолекулярных комплексов - изменения конформационной динамики полипептидной цепи белков при образовании комплексов разной природы: белок-белок/пептид, белок-ДНК, белок-РНК и белок-мембрана. Для достижения данной цели будет использован интегративный подход, основанный в первую очередь на комплементарных методах структурной биологии: ЯМР-спектроскопии, рентгеновских методах и микроскопии, а также тандемной масс-спектрометрии. Полученные экспериментальные данные будут интегрированы с вычислительными методами молекулярного моделирования и динамики (МД), включая классическую и ускоренную МД, для получения структурно-динамических моделей комплексов. В качестве конкретных объектов исследования будут выбраны биомолекулярные комплексы разной природы, играющие ключевые роли в функционировании бактериальных или эукариотических клеток и обладающие хорошо известным или предполагамым фармакологическим потенциалом. Будут исследованы взаимодействия архитектурных (нуклеоид-ассоциированных, НАБ) белков бактерий с модельной и нативной ДНК (ДНК-белок) и стеблевого комплекса рибосомы P1/P2 с белковым ингибитором трансляции (тройной РНК-белковый комплекс), а также взаимодействия в цитохром-содержащих электронпереносящих комплексах, включая комплекс мембран-связанных компонентов цитохром P450-зависимой системы человека (многокомпонентные белок-мембранные комплексы). Следует отметить, что понимание как НАБ, в первую очередь их наиболее распространённые представители – гистоноподобные белки регулируют архитектуру и функционирование бактериального генома важно для развития методов антибактериальной терапии, направленной против возбудителей социально-значимых инфекций, в том числе туберкулеза. Изучение «Стеблевого» комплекса рибосомы P1/P2 необходимо как для понимания фундаментальных основ процесса трансляции в клетках, так и для разработки противомикробных и противоопухолевых препаратов нового поколения. Информация о ключевых детерминантах межмолекулярного взаимодействия в системе цитохрома P450, поможет прогнозировать побочные эффекты, вызываемые вновь создаваемыми лекарственными препаратами и предсказать пути модуляции активности данной системы. Для модуляции структурно-динамических характеристик белковых комплексов, будет исследовано влияние биологически-активных пептидов как растительного происхождения, так и синтезированных de novo, на вышеперечисленные комплексы. На базе полученных результатов будет разработана эффективная методологическая платформа, позволяющая выбрать оптимальную комбинацию экспериментальных и вычислительных методов исследования на основе характеристик изучаемой биомакромолекулярной системы. В состав платформы войдут новые алгоритмы, улучшающие качество предсказания и валидации структуры и динамики молекулярных моделей различных белковых комплексов. Применение данной платформы позволит получать структурно-динамические модели биомакромолекулярных комплексов, востребованные в наукоемких биотехнологических разработках в фармацевтике и биомедицине.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Бершацкий Я.В., Кузнецов А.С., Идиатулина А.Р., Бочарова О.В., Долотова С.М., Гавриленкова А.А., Серова О.В., Деев И.Е., Ракитина Т.В., Зангиева О.Т., Павлов К.В., Батищев О.В., Бритиков В.В., Усанов С.А., Арсеньев А.С., Ефремов Р.Г., Бочаров Э.В. Diversity of Structural, Dynamic, and Environmental Effects Explain a Distinctive Functional Role of Transmembrane Domains in the Insulin Receptor Subfamily International Journal of Molecular Sciences, Issue 4, Volume 24, 2023 Feb 15, p.3906 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24043906

2. Цю Т., Джахангири А., Хань Х., Лесовой Д., Агбак Т., Агбак П., Ачур А., Цюй Х., Орехов В. Resolution enhancement of NMR by decoupling with the low-rank Hankel model Chemical Communications, том 59, выпуск 36, стр. 5475-5478 (год публикации - 2023)
10.1039/D2CC06682C

3. Агбак Т., Лесовой Д., Хан Х., Ломзов А., Сан Р., Сандалова Т., Орехов В.Ю., Ачур А., Агбак П. Combined NMR and molecular dynamics conformational filter identifies unambiguously dynamic ensembles of Dengue protease NS2B/NS3pro Communications biology, том 6, выпуск 1, стр.1193 (год публикации - 2023)
10.1038/s42003-023-05584-6

4. Савицкая А., Массо-Сильва Дж., Хаддауи И., Энани С. Exploring the arsenal of antimicrobial peptides: Mechanisms, diversity, and applications Biochimie, том 214, выпуск B, стр. 216-227 (год публикации - 2023)
10.1016/j.biochi.2023.07.016

5. Петухов М.В., Ракитина Т.В., Агапова Ю.К., Петренко Д.Е., Конарев П.В., Бритиков В.В., Бритикова Е.В., Бочаров Э.В., Штыкова Э.В. Сравнительное структурное исследование гистоноподобных белков HU методом малоуглового рентгеновского рассеяния Кристаллография, том 68, № 6, с. 914–921 (год публикации - 2023)
10.31857/S0023476123600143

6. Бершацкий Я.В., Надеждин К.Д., Бочарова О.Б., Арсеньев А.С., Бочаров Э.В. Dimerization of transmembrane domains of receptors of the insulin receptor subfamily. Biophysical Reviews, v. 15, pages 1425–1861, S1.32. (год публикации - 2023)
10.1007/s12551-023-01150-w

7. Рогожин Е.А. Подходы к выделению антимикробных пептидов микробного и растительного происхождения Материалы XIII Международной научной конференции «Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты», С. 220-221. (год публикации - 2023)

8. Рогожин Е.А., Иванов И.А., Дубинный М.А. Гидроксипролин-содержание антимикробные пептиды растений: химический синтез и биологическая активность Материалы Всероссийской научной конференции «Марковниковские чтения: Органическая химия от Марковникова до наших дней» (WSOC 2023), С. 88. (год публикации - 2023)

9. Валлерстайн Дж., Хан Х., Левковец М., Лесовой Д., Мальмодин Д., Мирабелло С., Валлнер Б., Сан Р., Сандалова Т., Агбак П., Карлссон Г., Ачур А., Агбак Т., Орехов В. Insights into mechanisms of MALT1 allostery from NMR and AlphaFold dynamic analyses Communications biology, том 7 , выпуск 1, стр. 868-885 (год публикации - 2024)
10.1038/s42003-024-06558-y

10. Рогожин Е., Бозин Т., Бочаров Э. Comparative structure-function analysis of plant defense peptide EcAMP1 from the alpha-hairpinin family to discover proline-19 substitution 8th International conference on chemistry, structure and function of biomolecules (г. Минск, Республика Беларусь, 1–5 октября 2024 г.) - Book of abstracts - Institute of Bioorganic Chemistry NASB, Minsk, 8th International conference on chemistry, structure and function of biomolecules (г. Минск, Республика Беларусь, 1–5 октября 2024 г.) - Book of abstracts, Стр. 48 (год публикации - 2024)

11. Петухов М.В., Ракитина Т.В., Агапова Ю.К., Петренко Д.Е., Подшивалов Д.Д., Тимофеев В.И., Петерс Г.С., Гапонов Ю.А., Бочаров Э.В., Штыкова Э.В. Молекулярная динамика и малоугловое рентгеновское рассеяние: сопоставление вычислительного и экспериментального подходов к изучению структуры биологических комплексов Кристаллография, Том 69, № 5, стр. 802-810 (год публикации - 2024)
10.31857/S0023476124050069

12. Петухов М.В., Ракитина Т.В., Конарев П.В., Бочаров Э.В.2, Штыкова Э.В. Structural investigation of histone-like HU proteins and their complexes with DNA oligonucleotides by SAXS and complementary methods С23 Сборник тезисов международной конференции «BIOMEMBRANES 2024» 07.10.2024-11.10.2024. Долгопрудный: МФТИ, 2024, Сборник тезисов международной конференции «BIOMEMBRANES 2024» 07.10.2024-11.10.2024. стр. 240 (год публикации - 2024)

13. Бритиков В.В., Бритикова Е.В., Бочаров Э.В., Усанов С.А. Взаимодействие рибосом-инактивирующего белка трихобакина с С-концевым фрагментом Р2 белка 80s рибосомы по данным корреляционной гетероядерной ЯМР спектроскопии Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: тезисы докладов 16-й Международной научной конференции, Республика Беларусь, Минск, 25–27 июня 2024 г. Издательство Белорусского государственного университета. , Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: тезисы докладов 16-й Международной научной конференции, Республика Беларусь, Минск, 25–27 июня 2024 г. Стр. 43-44 (год публикации - 2024)

14. Бочаров Э.В., Бершацкий Я.В., Лесовой Д.М., Павлов К.В., Кузьмина Н.В., Ракитина Т.В., Кузнецов А.С., Волынский П.Е., Бритиков В.В., Бритикова Е.В., Усанов С.А., Ефремов Р.Г., Арсеньев А.С. Конформационные перестройки и взаимодействия трансмембранных доменов битопных белков в норме и патологии Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: тезисы докладов 16-й Международной научной конференции, Республика Беларусь, Минск, 25–27 июня 2024 г. Издательство Белорусского государственного университета. , Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: тезисы докладов 16-й Международной научной конференции, Республика Беларусь, Минск, 25–27 июня 2024 г. Стр. 42 (год публикации - 2024)

15. Бритикова Е.В., Бритиков В.В., Бочаров Э.В., Усанов С.А. Динамика полипептидной цепи рибосом-инактивирующего белка трихобакина по данным 15N релаксационной ЯМР спектроскопии Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: тезисы докладов 16-й Международной научной конференции, Республика Беларусь, Минск, 25–27 июня 2024 г. Издательство Белорусского государственного университета. , Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: тезисы докладов 16-й Международной научной конференции, Республика Беларусь, Минск, 25–27 июня 2024 г. Стр. 45-46 (год публикации - 2024)

16. Рогожин Е.А., Барашкова А.С. Антибиотический потенциал алкалофильных актиномицетов из рода Streptomyces Сборник тезисов VIII Международной конференции «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов (MOSM 2024)» (г. Екатеринбург, Российская Федерация, 9-13 июня 2024 года) , VIII Международная конференция «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов (MOSM 2024)» - Сборник тезисов, Стр. A42 (год публикации - 2024)

17. Рогожин Е.А., Усачев К.С. Харпиноподобные пептиды растений — новые ингибиторы трансляции патогенных микроорганизмов Сборник тезисов Всероссийской конференции с международным участием «Биохимия человека 2024» (г. Москва, Российская Федерация, 17–19 октября 2024 года), ООО «Е-ното», Всероссийская конференция с международным участием «Биохимия человека 2024» (г. Москва, Российская Федерация, 17–19 октября 2024 года) - Сборник тезисов, Стр. 420 (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект направлен на изучение фундаментальных основ образования и стабильности макромолекулярных комплексов - изменения конформационной динамики полипептидной цепи белков при образовании комплексов разной природы: белок-белок/пептид, белок-ДНК, белок-РНК и белок-мембрана. Для достижения поставленных задач использовался интегративный подход, основанный на комплементарных методах структурной биологии. В 2024 г. для продолжения структурно-динамических исследований методом ЯМР-спектроскопии и другими биофизическими методами совместно с белорусскими коллегами был получен ряд белков, в том числе в меченом стабильными 15N,13C-изотопами варианте, а также мечение уширяющими спиновыми метками. наработаны рекомбинантные белки, включая пробные образцы изотопно-меченных белковых препаратов. Для изучения динамических белковых комплексов, были выбраны рибосом-инактивирующий белок трихобакин, ДНК-связывающие гистоноподобные белки бактерий, а также растворимые цитохромы бактерий и млекопитающих. Для полученных белковых препаратов был проведён анализ структурной гомогенности и стабильности с использованием электрофоретических, спектральных, хроматографических, и физико-химических методов. Для отнесения 1H,13С,15N-химических сдвигов основной полипептидной цепи и боковых групп, расчета пространственной структуры и описания внутримолекулярной динамики для 15N- и 15N,13C-изотопно-меченых белков в составе комплексов (рибосом-инактивирующий белок трихобакин и его мутанты в комплексе с фрагментами стержневого P2 белка эукариотической рибосомы; полноразмерный и укороченный цитохром С552 в окисленном состоянии в комплексе с ферментом тиоцианат-дегидрогеназа; фрагмент лимфома-транслокационного белка 1 MALT1 в мономерной и димерной форме) были накоплены, обработаны и проанализированы серии корреляционных двумерных и трехмерных гетероядерных ЯМР-спектров. По степени пертурбации химических сдвигов на основе серии измерений ЯМР-спектров исследуемых белков при титровании их лигандами получено картирование паттернов аминокислотных остатков, вовлеченных в образование комплекса. Для описания кинетики реакции комплексообразования, механизма реакции и определения равновесной константы диссоциации комплексов применён метод двумерного анализа формы линий ЯМР кросс-пиков в титрационном эксперименте. Для идентификации конформационных ансамблей динамических белковых комплексов, доминирующих в растворе, доработан метод «конформационного фильтра», комбинирующего релаксационные данные ЯМР о подвижности основной и боковых цепей белков с молекулярной динамикой. Апробация метода была проведена на примере функционального фрагмента белка MALT1, который является целью для разработки терапевтических соединений при лечении лимфомы и других видов рака. Используя измерения скоростей 15N-релаксации основной цепи белка совместно с ЯЭО взаимодействиями между метильными группами боковых цепей, была получена информация о вращательной диффузии, внутренней динамики и междоменного движения, что позволило раскрыть механизмы, лежащие в основе аллостерической регуляции фермента. Для нигеллотионинов семян черного тмина на основании выравнивания первичных структур шести высоко гомологичных молекул были локализованы три положения в полипептидной цепи, замены аминокислотных остатков в которых могут являться функционально важными. Проведено сравнительное тестирование шести выделенных нигеллотионинов на две модельных оппортунистических грибных тест-культуры. Для отобранной пары тионинов проведена оценка антипролиферативной на опухолевой линии клеток немелкоклеточного рака легких. Сопоставление значений ИК50 по гемолитической и цитотоксической активности тионинов позволило позиционировать данные молекулы как перспективные кандидаты для дальнейших биомедицинских исследований. Изучена способность тионинов увеличивать ионную проницаемость искусственных липидных бислоев, моделирующих, соответственно, составы клеточных мембран прокариотических и эукариотических клеток. Методом АСМ были получены структурные данные низкого разрешения для комплексов цитохрома c552 с ферментом тиоцианат-дегидрогеназой и проведён их сравнительный анализ с ЯМР-данными. Анализ топографии совместно с фазовым контрастом комплекса показал, что CytC552 располагается в смещенном от центра TcDH положении, из чего можно предполагать, что взаимодействие осуществляется через неструктурированные IDP участки на N- и С-концах цитохрома. При исследовании ДНК-белковых комплексов был обнаружен феномен, ранее не описанный в научной литературе, что как свободный гистоноподобный белок HUMgal, так и его комплексы с ДНК в условиях АСМ экспериментов находятся в жидкокапельной форме. На основании структурных данных, полученных в МУРР экспериментах, и молекулярного моделирования получены модели низкого разрешения комплексов микоплазменных HU белков с модельными двухцепочечными ДНК разной длины и природы, имитирующими правильную и поврежденную ДНК. Установлено, что для коротких ДНК предпочтительным является связывание с участием седловидной стабильной области ДНК-связывающего домена и изгибанием ДНК вдоль альфа-спирального домена димера HU белка. Следует отметить, что использование структурных характеристик комплексов, полученных методом МУРР, для валидации структурных пространственных моделей, полученных в МД и ЯМР экспериментах, значительно снизило амбивалентность теоретических предсказаний и подтвердило комплементарность методов ЯМР, МД и МУРР для решения задач структурной биологии.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году было завершено комплексное изучение белковых взаимодействий и их динамики с использование многоуровневого подхода, интегрирующего экспериментальные и вычислительные методы. Проведённые исследования охватывали разнообразные аспекты межмолекулярных взаимодействий от фундаментальных принципов ассоциации макромолекул и роли столкновительных комплексов до детального анализа конформационных ансамблей с помощью ЯМР и молекулярной динамики. В рамках разработанной платформы каждый метод вносил свой уникальный вклад в общую картину, т.к. именно комплексный интегративны подход позволял преодолеть методологические ограничения, такие как низкое временное разрешение кристаллографии, усредненный характер данных МУРР или необходимость валидации силовых полей. Следует отметить, что 2025 год был посвящён практической валидации разработанного интегративного подхода, в рамках которой был проведён расчёт структур динамических белковых комплексов, основанный на двух принципах: 1). Генерирование экспериментальных ограничений, полученных по данным экспериментальных методов (ЯМР–спектрометрия или малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР)) и включение их в алгоритм выбранного вычислительного метода. 2) Сравнение сгенерированных in silico конформаций комплексов с экспериментальными структурными данными с целью выбора валидных моделей. При проведении работ, данные ЯМР–спектрометрии по пертурбации химических сдвигов (CSP) использовали для того, чтобы рассчитать начальную конформацию методом информационно-управляемого докинга с использованием CSP ограничений. После выбора наилучших кандидатов по значению скоринговой функции, проводили релаксации комплекса при помощи молекулярной динамики (МД) и анализировали полученные МД траектории, применяя метод корреляционного анализа для выбора искомых структур комплексов или ансамбля состояний. Объектами исследования были биомолекулярные комплексы разной природы, играющие ключевые роли в функционировании бактериальных или эукариотических клеток и обладающие хорошо известным или предполагаемым фармакологическим потенциалом. В случае комплекса рибосом-инактивирующего белка трихобакина (TBK) с С-концевым фрагментом P2 рибосомного белка (ТВК-Р2) комплексное применение методов ЯМР-спектроскопии и молекулярного моделирования позволило сформулировать новый механизм регуляции функциональной активности ТВК, выходящий за рамки традиционных представлений. Ключевым открытием является передача динамических возмущений от периферийного сайта связывания рибосомы на поверхности ТВК к удаленному каталитическому центру ТВК через механизм динамической аллостерии. Предложенная модель предоставляет убедительное и физически обоснованное объяснение парадоксальному, описанному в литературе, тысячекратному падению каталитической активности TBK в отсутствие белка P2. Обнаруженный путь регуляции по типу динамический аллостерии не только углубляет понимание функционирования ТВК, но и открывает новые перспективы для исследования механизмов действия целого класса рибосом-инактивирующих белков. На примере цитохрома c552 и его комплекса с тиоцианатдегидрогеназой (TcDH) продемонстрирована эффективность платформы для анализа слабых, транзиентных белковых взаимодействий. Установлено, что связывание не приводит к грубым конформационным перестройкам или изменению глобальной динамики глобулярного домена, а проявляется в тонкой модуляции временных масштабов коллективных движений и изменении тензора вращательной диффузии, что указывает на режим быстрой либрации комплекса. Выявлена критическая роль IDR-участков в модуляции функциональной активности, не связанная напрямую с изменением аффинности связывания. Для HU-белков комбинация МУРР и МД позволила построить структурные модели ДНК-белковых комплексов в растворе и охарактеризовать конформационную гибкость, ответственную за связывание с ДНК. Таким образом, на завершающем году выполнения проекта было продемонстрировано, что разработанная интегративная платформа представляет собой мощный инструмент для получения всесторонних структурно-динамических моделей биомолекулярных систем. Ее применение позволяет не только описывать статическую структуру, но и количественно характеризовать конформационный ансамбль, динамику и механизмы взаимодействия, что является основой для рационального дизайна молекул с заданными свойствами в биотехнологии и фармакологии. Было показано, как синeргия между постоянно совершенствующимися экспериментальными техниками и вычислительными мощностями, включая передовые методы искусственного интеллекта, открывает путь к созданию предсказательных платформ, способных не только описывать, но и прогнозировать динамическое поведение биомолекулярных систем в их полной сложности и многогранности.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Универсальная методологическая платформа для комплексного исследования взаимосвязи «структура-динамика-функция», применимая к широкому классу биомакромолекул имеет широкие перспективы практического использования в экономике и социальной сфере, так как может служить основой для формирования научных и технологических заделов, обеспечивающих экономический рост и социальное развитие Российской Федерации в области здравоохранения и биотехнологий. Практически любое предложение по внедрению полученных фундаментальных данных о биомакромолекулярных комплексах в биомедицинские и фармацевтические разработки, сформулированное в отчёте за 2025 год, может быть положено в основу создания новой или усовершенствования имеющейся биомедицинской технологии. Примерами технологий, которые могут быть усовершенствованы за счёт использования разработанной методологической платформы, является область биотехнологического получения рекомбинантных белков, обладающих фармацевтической значимостью и используемых для создания лекарственных и диагностических средств в медицине и ветеринарии. Полученные методологические решения и алгоритмы анализа могут быть успешно адаптированы для изучения сложных надмолекулярных ансамблей, таких как рибосомы, сплайсосомы, сигналосомы и др., открывая новые пути для управления их функцией, которые лягут в основу инновационных подходов к решению проблем борьбы с различными патологическими состояниями от орфанных болезней до социально-значимых заболеваний. Ещё одним направлением практического использования платформы является рациональный дизайн низкомолекулярных или пептидных лигандов, специфичных к определённым белковым мишеням, включая молекулы, меченные флуоресцентными или парамагнитными метками, для исследований in vitro и in vivo с применением методов конфокальной микроскопии или магнитно-резонансной томографии, что открывает возможности для разработки тераностических препаратов.