Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Фундаментальной задачей данного проекта является оценка противоопухолевого действия супрамолекулярной системы доставки на основе циклодекстрина (CD) и гиалуроновой кислоты (HA), нагруженной противоопухолевым препаратом (доксорубицином), для терапии гемобластозов. Во второй год проекта было запланировано проведение оценки влияния данного комплекса как in vitro (оценка влияния на пролиферативную активность, субпопуляционный состав и фенотипические и функциональные характеристики клеток крови условно-здоровых доноров и пациентов с гемобластозом), так и in vivo (оценка противоопухолевого действия на мышиной модели гемобластоза). Образцы венозной крови были получены от 22 условно здоровых доноров и 15 пациентов с хроническим лимфолейкозом, наблюдаемых амбулаторно в клинике иммунопатологии НИИФКИ. У всех исследуемых была взята кровь из кубитальной вены в одноразовые пробирки с литий-гепарином (Sarstedt, Германия) в объеме 9 мл. От всех доноров и пациентов было получено информированное письменное согласие. Мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК) были выделены из образцов крови с использованием стандартного метода градиента плотности фиколла-урографина (d = 1,077 г/см3). Для экспериментов in vitro доксорубицин (DOX) использовали в концентрациях 16, 1,6, 0.16 и 0,016 мкг/мл. HACD добавляли к DOX в пропорции 5:1. Например: DOX 16 мкг/мл и 80 мкг/мл HACD.МНК ПК условно-здоровых доноров и пациентов культивировали в клеточной среде RPMI-1640 («ПанЭко», Москва, Россия) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой («Thermo Fisher Scientific», Уолтем, Массачусетс, США) с добавлением исследуемых соединений в течение 72 часов. При оценке влияния HACD-DOX на жизнеспособность МНК ПК здоровых доноров было обнаружено, что HACD-DOX снижал жизнеспособность МНК ПК в самой высокой используемой концентрации, соответствующей 16 мкг/мл DOX. При этом сам DOX и система доставки без используемого противоопухолевого препарата HACD в эквивалентных концентрациях не оказывали токсического действия на клетки. При оценке экспрессии CD44, рецептора на клетках периферической крови условно-здоровых доноров и пациентов с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) было показано, что относительная доля клеток, несущих на себе CD44, среди различных субпопуляций мононуклеарных клеток крови не различалась у условно здоровых доноров и пациентов с ХЛЛ, уровень экспрессии данного маркера различался. У пациентов с ХЛЛ по сравнению с донорами экспрессия CD44 повышалась на Т-хелперах, но при этом снижалась на B-лимфоцитах и моноцитах. Также следует отметить, что у пациентов с ХЛЛ по сравнению с донорами было выше относительное количество В лимфоцитов, большинство из которых были CD5+, что отражает патогенез данного заболевания. Кроме того, наблюдалось снижение относительного количества остальных исследуемых популяций лейкоцитов, в первую очередь NK клеток и моноцитов. Далее нами было оценено действие HACD-DOX на МНК ПК условно-здоровых доноров и пациентов с ХЛЛ, Было обнаружено, что добавление к культуре клеток доноров или пациентов HACD-DOX либо его компонентов не приводит к изменению относительного количества основных популяций МНК ПК, таких, как Т-лимфоциты, моноциты, NK-клетки, В лимфоциты. Несмотря на то, что большая часть клеток CD19+ у пациентов являлась опухолевыми, изменение численности данных клеток у пациентов при воздействии DOX либо HACD-DOX не обнаружено. При этом имеется тенденция по увеличению пролиферативной активности Т-хелперов у доноров по сравнению контролем, а HACD-DOX приводит к усилению пролиферативной активности Т-хелперов по сравнению с контролем, тогда как у пациентов такого эффекта не наблюдалось. В случае цитотоксических CD8+ Т лимфоцитов пролиферативная активность данных клеток была снижена в контроле у пациентов по сравнению с контролем у доноров, что свидетельствует о более слабой функциональной активности данных клеток при БХЛЛ. Следует отметить, что у доноров наблюдалась лишь тенденция по усилению пролиферации CD8+ клеток при культивировании в присутствии HACD-DOX, тогда как у пациентов и HACD, и HACD-DOX повышали число пролиферировавших клеток. При оценке внутриклеточного содержания перфорина и гранзима в различных субпопуляциях клеток-киллеров анализ полученных данных показал, что доксорубицин повышал долю содержащих перфорин и гранзим СD8+ клеток у пациентов с ХЛЛ. HACD-DOX не приводил к достоверному увеличению данных клеток у пациентов, однако имелась тенденция. У доноров же наблюдалась тенденция по увеличению доли NK-клеток, содержащих перфорин и гранзим. Вместе с данными о том, что уровень экспрессии маркера дегрануляции не изменялся, можно предположить, что доксорубицин и комплекс на его основе усиливают продукцию перфорина и гранзима, что, в свою очередь, способно усиливать противоопухолевый ответ. При оценке влияния HACD-DOX на жизнеспособность опухолевых клеток линии WEHI-3 было показано, что свободный DOX, как и комплекс, снижали данный показатель при использовании концентраций, эквивалентных 16 мкг/мл и 1,6 мкг/мл. Достоверных различий между действием свободного DOX и HACD-DOX обнаружено не было. Далее нами была проведена оценка противоопухолевого действия HACD-DOX в модели миеломоноцитарной лейкемии. Разницы в показателях веса мыши и изменении массы печени и селезенки у животных на момент вывода из эксперимента мы не наблюдали . Тем не менее, было обнаружено, что HACD-DOX увеличивал продолжительность жизни как при сравнении с группой мышей без терапии, так и группами после введения только DOX или HACD. Предположительно, наблюдаемые различия могут быть связаны с большей стабильностью HACD-DOX в условиях in vivo, тогда как свободный DOX менее направленно взаимодействует с клетками организма, что приводит к быстрому снижению концентрации и меньшему эффекту.