Молекулярные детерминанты регуляции катионных каналов DEG/ENaC как новые потенциальные мишени противоопухолевой терапии

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-25-00126

НазваниеМолекулярные детерминанты регуляции катионных каналов DEG/ENaC как новые потенциальные мишени противоопухолевой терапии

Руководитель Сударикова Анастасия Владимировна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук , г Санкт-Петербург

Конкурс №78 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова ионные каналы, транспорт натрия, эпителиальные натриевые каналы, протон-управляемые ионные каналы, ASIC, DEG/ENaC, pH, клеточная сигнализация, плазматическая мембрана, сериновые протеазы, актиновый цитоскелет, трансформированные клетки крови

Код ГРНТИ76.03.33

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Ионные каналы являются трансмембранными белковыми комплексами и участвуют в регуляции множества физиологических функций клеточных мембран в норме и патологии. Известно, что способность опухолевых клеток мигрировать и пролиферировать критически зависит от мембранного потенциала, изменения объема клеток и механических свойств плазматической мембраны. Регуляция вышеперечисленных функций опухолевых клеток тесно связана с работой различных типов ионных каналов. Важнейшие аспекты ионного баланса при злокачественных заболеваниях, в том числе при заболеваниях крови, недостаточно изучены. Появляется все больше доказательств того, что два представителя натриевых каналов суперсемейства DEG/ENaC - ENaC (epithelial Na+ channels) и ASIC (acid sensing ion channels) - играют важную роль в поведении раковых клеток, включая пролиферацию, апоптоз, инвазию и миграцию. Однако изучение конкретных молекулярных механизмов регуляции активности ENaC и ASIC в опухолевых клетках крови находятся на начальном этапе. Ранее в наших исследованиях в клетках миелоидной лейкемии человека были обнаружены амилорид-нечувствительные натрий-селективные каналы ENaC и протон-управляемые ионные каналы ASIC1а. Внутриклеточные пути регуляции каналов ENaC были напрямую или опосредованно связаны с динамикой примембранного актина, внеклеточные - с действием сериновых протеаз. Остается нерешенным вопрос об аддитивности стимулирующего действия внеклеточного протеолиза и разборки актинового цитоскелета, а также о возможном вовлечении каналов ENaC в процессы миграции, инвазии и пролиферации трансформированных клеток крови. Каналы ASIC активируются при закислении внеклеточной среды и являются одними из наиболее чувствительных молекулярных сенсоров изменения внеклеточного pH. Однако роль актиновых филаментов в их регуляции практически не изучена, как и возможный субъединичный состав ASIC в клетках лейкемии. Конкретная фундаментальная задача настоящего проекта состоит в выяснении внутри- и внеклеточных механизмов регуляции активности каналов DEG/ENaC, а именно ENaC и ASIC, отвечающих за вход ионов Na+ в опухолевых клетках, прежде всего в трансформированных клетках крови. Представляет интерес проверка гипотезы о наличии функционально-активных протон-управляемых каналов ASIC с разным субъединичным составом в плазматической мембране клеток миелоидной лейкемии человека. Может быть определена роль актинового цитоскелета в функционировании каналов ASIC в плазматической мембране трансформированных клеток крови. Может быть дан ответ на вопрос, в какой степени вовлечен актиновый цитоскелет в процессы функционирования натриевых каналов, активированных внеклеточными регуляторами. Таким образом, в рамках проекта ожидается получить новые актуальные данные фундаментального характера о молекулярных детерминантах регуляции активности каналов ENaC и ASIC, которые могут стать новой потенциальной мишенью в современных фармакологических препаратах, модулирующих свойства мембран и каналов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Лысикова Д.В., Васильева В.Ю., Чубинский-Надеждин В.И., Морачевская Е.А., Сударикова А.В. Capsazepine activates amiloride-insensitive ENaC-like channels in human leukemia cells Biochemical and Biophysical Research Communications, 687: 149187 (год публикации - 2023)
10.1016/j.bbrc.2023.149187

2. Лысикова Д.В., Васильева В.Ю., Цаплина О.А., Морачевская Е.А., Чубинский-Надеждин В.И., Сударикова А.В. Role of Actin Dynamics in the Control of Proteolytically Induced ENaC‐Like Channel Activity In Human Leukemia Cells Cell and Tissue Biology, 2025: 19(1), pp. 48–54 (год публикации - 2025)
0.1134/S1990519X25010055

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
С помощью селективных ингибиторов протон-управляемых каналов псалмотоксина-1 PcTx1 (ингибитор ASIC1) и APETx2 (ингибитор ASIC3) была подтверждена принадлежность зарегистрированных в мембране клеток лейкоза линии К562 pH-чувствительных каналов к семействам ASIC1 и ASIC3. В части экспериментов было обнаружено одновременное блокирование протон-чувствительных каналов с помощью PcTx1 и APETx2, что указывает на присутствие в мембране К562 гетеротримерных ASIC, состоящих из субъединиц ASIC1/ASIC3. Значение pH50, необходимое для полумаксимальной активации токов через ASIC1а, составило 5.85, концентрация полумаксимального ингибирования псалмотоксином-1 (PcTx1) составила 43 нМ. С помощью прижизненной микроскопии с флуоресцентным кальциевым индикатором Fluo-8 обнаружено, что активация каналов ASIC1 при снижении рН раствора может увеличивать уровень внутриклеточной концентрации кальция в клетках К562, в то время как PcTx1 снижал этот эффект. С использованием деструктора актинового цитоскелета цитохалазина Д (ЦитД) было установлено, что состояние кортикального актинового цитоскелета влияет на уровень активности и функциональные свойства каналов ASIC: было показано уменьшение амплитуды ASIC3-активируемых токов на ~40% при действии ЦитД. Также в части опытов в ответ на разборку актиновых филаментов наблюдался эффект сопряжения ASIC1a с актин-управляемыми натриевыми каналами: после быстрой активации протон-чувствительных токов далее следовало развитие активности каналов с кинетикой ENaC, что может объясняться присутствием в мембране К562 каналов-гетерокомплексов, включающих ASIC1a и субъединицы ENaC. Также в клетках К562 была определена роль актинового цитоскелета в функционировании каналов ENaC, активируемых внеклеточным протеолизом с помощью трипсина. Показано, что протеолитическая активация каналов не требует разборки актина, при этом сборка актина на цитоплазматической стороне мембраны обеспечивает быструю инактивацию ENaC. Далее мы установили, что сериновые протеазы α-химотрипсин и плазмин напрямую активируют каналы ENaC в клеточных линиях лейкоза K562 и U937. Было подтверждено, что активация каналов требует каталитической активности α-химотрипсина и плазмина. Используя метод направленной миграции/инвазии клеток через полупроницаемую мембрану, мы впервые показали, что α-химотрипсин и плазмин значительно снижают скорость миграции и инвазии клеток K562. Такой же эффект α-химотрипсина на миграцию был подтвержден на различных клеточных линиях лейкоза (U937, HL-60). Инкубация клеток с сериновыми протеазами в присутствии их ингибиторов (SBTI или α2-антиплазмин) не влияла на способность клеток к миграции/инвазии, что указывает на важную роль каталитической активности сериновых протеаз в регуляции подвижности клеток лейкоза. Более того, не было выявлено влияния α-химотрипсина на миграционную способность клеток лейкоза MOLT-4, которые не экспрессируют функционально активные каналы ENaC. В то же время с помощью МТТ-теста не было выявлено статистических различий в пролиферативном статусе клеток К562 в контрольных условиях и после их инкубации с сериновыми протеазами.

Публикации