Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Разработан прототип клеточного продукта на основе регуляторных Т-клетках (Трег), обладающих повышенной супрессорной активностью по отношению к аутореактивным Т-клеткам пациентов с боковым амиотрофическим склерозом (БАС). Клеточный продукт был получен путём индукции полноразмерного (full-length FoxP3, FL FoxP3) переключающими сплайсинг олигонуклеотидами (ПСО). Изолированные из периферической крови пациентов с БАС Трег трансфицировали двумя ПСО, ответственными за вставку экзона 2 (#Ins2) и экзона 7 (#Ins7). Это приводило к индукции и селективной экспрессии только варианта FL. Наличие белковой формы FL FoxP3 подтвердили методом вестерн-блоттинга с использованием антител, специфичных к данному белковому варианту. Трансфицированные клетки культивировали в ростовой среде ex vivo в течении 96 ч. Методом проточной цитометрии определено количество клеток, экспрессирующие ассоциированные с Трег маркёры. FL FoxP3 Трег были CD4+ положительными (95,2–99,3%) и их количество не отличались от контрольных клеток. Количество клеток с фенотипом CD25+ также не менялось между FL FoxP3 Трег (98,6 – 99,8%) и контрольными клетками. Незначительная индукция клеток с фенотипом CD127low наблюдалась у Трег после индукции FL FoxP3 до 86,4 – 89,3%. Индукция FL FoxP3 приводила к значительному увеличению клеток с рецептором CD152 до 90,2 – 99,6% и транскрипционным фактором Helios – до 91,4 – 96,6 %. Проведен анализ пролиферативной активности. Трег с индуцированным FL FoxP3 демонстрировали значительно более высокую долю пролиферирующих клеток: через 96 часов после трансфекции 86,1% Трег с FL FoxP3 подверглись делению по сравнению с 65,8% контрольных Трег. Клетки, экспрессирующие FL FoxP3, пролиферировали с высокой скоростью и через 96 ч после трансфекции их общее количество достигало 6,01 ± 0,52 х 10^7, а частота деления клеток в сутки составляла 0,65. Пролиферирующие Трег фотографировали с помощью инвертированного микроскопа для контроля их морфологии. Контрольные Трег начали формировать клеточные агрегаты или так называемые пролиферационные кластеры через 72 часа после трансфекции, тогда как клетки FL FoxP3 были способны формировать их через 48 часов, и количество кластеров было больше. Размер кластеров пролиферации составлял 60–100 мкм и не различался между группами Трег. Определение супрессивной активности Трег проводили методом реакции смешанных лимфоцитов. Контрольные Трег были способны подавлять пролиферацию целевых таргетных CD4+CD25- T-клеток в соотношении 1:16, тогда как FL FoxP3 Трег были в четыре раза более активны и могли подавлять клетки-мишени даже в соотношении 1:64. Методом проточной цитометрии с применением соответствующих антител определено количество Трег, синтезирующих молекулы, вовлеченных в реализацию супрессорной активности. Количество клеток, экспрессирующих CD39, была высокой у FL FoxP3 Трег с (90,3 – 97,5%) и не отличалась от контроля. Доля клеток, экспрессирующих CD223, была высокой (81,0 – 96,6%) и не различалась от контроля. При индукции FL FoxP3 наблюдалось увеличение клеток с молекулами, индуцирующими апоптоз: 74,3 – 85,7% клеток экспрессировали гранзим А, и 62,6 – 76,3% экспрессировали гранзим В. Доля перфорин-положительных клеток увеличивалась до 80,0–92,1% после индукции FL FoxP3. Остаточная теломеразная активность в клетках-мишенях, совместно инкубированных с контрольными Трег, составляла 44,4 – 59,2%. Трег с индуцированной экспрессией варианта сплайсинга FL показали более высокую способность подавлять теломеразу– 9,5–23,1%. Способность Трег продуцировать цитокины, участвующие в контактно-независимой супрессии, определяли измеряя их концентрацию в средах для культивирования клеток с использованием анализа Bio-Plex. Концентрация IL-10 составляла 165– 342 пг/мл в средах от контрольных клеток, тогда как в средах от FL FoxP3 Трег она была достоверно повышена – 410– 722 пг/мл. Концентрация IL-35 также повышалась с 172–390 пг/мл у контрольных клеток до 502–862 пг/мл у FL FoxP3 Трег. Используя данные подходы, нами был получен и охарактеризован прототип клеточного продукта на основе Трег клеток, потенциально применимый для регенеративной терапии БАС. Полученa клеточная культура Трег клеток, моделирующая Трег пациентов с болезнью Шегрена. Выделенные Трег четырех здоровых доноров трансфицировали парой ПСО, специфично модулирующих сплайсинг экзонов 2 или 7. ПСО #Ins2 мог индуцировать включение экзона 2, в то время как ПСО #Del7 был способен индуцировать делецию экзона 7. Трансфекция Трег этой парой олигонуклеотидов привело к получению культуры Трег с селективной экспрессией delta7 FoxP3. Пролиферативная активность Трег с delta7FoxP3 была значительно снижена. 2,21 ± 0,18 x 10^7 клеток было получено в группах Трег, экспрессирующих вариант delta7, по сравнению с 5,12 ± 0,22 x 10^7 в группе контрольных клеток. Контрольные клетки образовывали клеточные кластеры или агрегаты размером 60–80 мкм. Клетки с delta7FoxP3 кластеры пролиферации не образовывали. Анализ иммунофенотипа методом проточной цитометрии показал, что маркеры CD4 и CD25 присутствовали в всех группах Трег. Количество клеток с маркером CD127low было понижено до 21,5 ± 2,4% в группе Трег с delta7FoxP3. Также наблюдали понижение количества клеток с маркером Helios до 4,7 ± 2,9% при делеции экзона 7. Анализ супрессорной активности Трег с delta7FoxP3 показал, что их супрессорная активность проявлялась лишь в соотношении 1:8, в то время как у контрольных клеток данное соотношение было в 1:32, т.е. супрессорная активность клеток с укороченным вариантом была на 75% ниже, по сравнению с контрольными. Анализ уровня экспрессии молекул, вовлеченных в реализацию супрессорной активности показал, почти все клетки delta 7 были гранзим А-положительными (92,1 ± 3,1%). Делеция экзона 7 приводила к небольшому уменьшению количества клеток, синтезирующих гранзим В (35,3 ± 7,4%). Однако доля перфорин-позитивных контрольных клеток увеличивалась до 64,4 ± 8,9% после индукции. Наблюдали понижение уровня клеток, экспрессирующих маркеров CD39 и CD223 в группе delta7FoxP3 до очень низкого уровня менее 3%. Однако уровень CD152 оставался высоким – более 98%. Используя метод анализа амплификиции теломерных повторов показали, что Трег с delta7FoxP3 способны подавлять активность теломеразы в таргетных лимфоцитах лишь на 22%, в то время как у контрольных клеток этот показатель составил 80%. Понижение способности супрессировать теломеразу не соотносилось со способностью этих клеток синтезировать цитокины, вовлеченные в реализацию контакт-независимого супрессорного действия. Контрольные клетки синтезировали интерлейкин 10 на уровне 832±174 пг/мл, а интерлейкин 35 на уровне 1016±125 пг/мл, эти значения незначительно понижались до уровня 732±141 пг/мл 893±172 пг/мл, соответственно у delta7FoxP3 Трег. Используя данные подходы, была получена и охарактеризована клеточная культура Трег клеток, моделирующих Трег пациентов с болезнью Шегрена.