Разработка эмбриотехнологической системы получения, консервации и использования биоматериала лошадей для сохранения генетических ресурсов коневодства, их селекционного совершенствования и генетической коррекции.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-16-00226

НазваниеРазработка эмбриотехнологической системы получения, консервации и использования биоматериала лошадей для сохранения генетических ресурсов коневодства, их селекционного совершенствования и генетической коррекции.

Руководитель Лебедева Людмила Федоровна, Доктор сельскохозяйственных наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт коневодства" , Рязанская обл

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-204 - Животноводство

Ключевые слова лошади, эмбрионы, ооциты, криоконсервация, экстракорпоральное оплодотворение, эмбриотрансплантация, культивирование, генетические ресурсы, селекция

Код ГРНТИ68.39.13

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Применение биотехнологических методов воспроизводства крайне актуально в коневодстве в связи с рядом факторов, основными из которых являются малая численность поголовья пород лошадей, низкие темпы воспроизводства в традиционной селекции, обусловленные видовой малоплодностью и участие выдающихся представителей пород в испытаниях и соревнованиях в сроки, совпадающие с оптимальным репродуктивным периодом. Традиционно применяемые методы, основанные на создании и использовании в селекции криобанков семени жеребцов-производителей не позволяют полноценно подходить к реализации стратегий сохранения пород лошадей и широкого использования в селекции всех ценных генотипов, так как не учитывают необходимость сохранения генетического материала кобыл. Долгие сроки воспроизводства (11 месяцев жеребости, одноплодность) и оценки племенных качеств зачастую не позволяют в достаточной мере получить потомство от ценнейших в селекционном отношении кобыл. Всё это является предпосылками необходимости разработки системы, основанной на применении биотехнологических методов работы с ооцитами, экстракорпорального оплодотворения, клонирования и эмбриотрансплантации в коневодстве. Проект направлен на изучение фундаментальных основ видовых аспектов развития ооцитов Equus caballus, молекулярных механизмов созревания яйцеклеток, оценки компетентности биоматериала для проведения работ по экстракорпоральному оплодотворению и криоконсервации. В ходе исполнения будут разработаны усовершенствованные протоколы получения, оценки и работы с ооцитами и яйцеклетками, получен биологический материал для получения экспериментальных животных, наработан криобанк генетического материала для проведения дальнейших исследований в области клонирования и генетического редактирования в коневодстве. Будут проведены сравнительные исследования, направленные на определение возможностей использования соматических клеток, полученных из разных источников, для клонирования и оценки их компетентности. Это позволит предложить опережающие системы селекционного совершенствования пород лошадей, основанные на тиражировании ценных генотипов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Солодова Е.В., Красильникова Е.А Эффективность применения отечественных аналогов гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ) для индукции овуляции и прогнозирования сроков аспирации преовуляторных фолликулов у кобыл с целью возможного применения в циклах ВРТ КОНЕВОДСТВО И КОННЫЙ СПОРТ, №3,стр. 7-11 (год публикации - 2023)
10.25727/HS.2023.3.60759

2. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Зайцев А.М., Блохина Н.В., Калинкина Г.В., Стародумов М.И., Сулейманов О.И., Дацышин А.А., Шемарыкин, А.Е., Рыгина Е.С. Современные вызовы в коневодстве России и биотехнологические методы в селекции лошадей КОНЕВОДСТВО И КОННЫЙ СПОРТ, №4, стр. 4-8 (год публикации - 2023)
10.25727/HS.2023.4.60603

3. Калашников В. В., Лебедева Л. Ф., Солодова Е.В. Репродуктивные технологии в Российском коннозаводстве Материалы Всероссийской школы-конференции. Пушкин, 2023, стр. 56-57 (год публикации - 2023)
10.31043/2410-2733-2023-5-56-57

4. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Зайцев А.М., Блохина Н.В., Калинкина Г.В., Стародумов М.И., Сулейманов О.И., Дацышин А.А., Шемарыкин, А.Е., Рыгина Е.С., Баковецкая О.В.,, Терехина А.А., Булатова А.А. Современные вызовы в коневодстве России и биотехнологические методы в селекции лошадей КОНЕВОДСТВО И КОННЫЙ СПОРТ, № 6, С.4-9 (год публикации - 2023)

5. Калашников В.В., Лебедева л.Ф., Солодова, Баковецкая О.В., Е.В., Терехина А.А., Булатова А.А. Ооциты лошадей как экспериментальная модель изучения процессов оплодотворения in vitro Сборник докладов IX Всероссийской научной конференции с международным участием молодых специалистов, аспирантов, ординаторов «Инновационные технологии в медицине: взгляд молодого специалиста», С.120-122 (год публикации - 2023)

6. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Зайцев А.М., Блохина Н.В., Калинкина Г.В., Стародумов М.И., Сулейманов О.И., Дацышин А.А., Шемарыкин, А.Е., Рыгина Е.С. Современные вызовы в коневодстве России и биотехнологические методы в селекции лошадей КОНЕВОДСТВО И КОННЫЙ СПОРТ, №5, стр. 4-9 (год публикации - 2023)
10.25727/HS.2023.5.60148

7. Калашников В.В., Багиров В.А., Зайцев А.М., Лебедева Л.Ф., Атрощенко М.М., Науменкова В.А., Калинкова Л.В., Андриянец Т.В., Калинкина Г.В., Рябова Т.Н., Абрамова Н.В., Халилов Р.А., Шемарыкин А.Е., Брагина Е.Е. Экспериментальное моделирование генотипов лошадей с использованием семени производителей длительных сроков хранения и вспомогательных репродуктивных технологий Коневодство и конный спорт, №4, С. 4-10 (год публикации - 2024)
10.25727/HS.2024.4.60745

8. Сакаев В.А., Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Солодова Е.В. Подготовка спермы жеребцов для оплодотворения ооцитов in vitro в программах ВРТ БИОСИСТЕМЫ: ОРГАНИЗАЦИЯ, ПОВЕДЕНИЕ, УПРАВЛЕНИЕ Тезисы докладов 77-й Международной школы-конференции молодых ученых. Нижний Новгород, 2024. Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского", С. 316 (год публикации - 2024)

9. Калашников В.В., Солодова Е.В., Лебедева Л.Ф. Current state of horse embryo transfer technology in Russia and factors influencing its effectiveness BIO WEB OF CONFERENCES, 121, 01004 (2024) (год публикации - 2024)
10.1051/bioconf/202412101004

10. Лебедева Л.Ф., Баковецкая О.В. Терехина А.А., Солодова Е.В., Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В., Балашова С.С. Inflammation and Apoptosis Factors in Mares’ Follicular Fluid in the Aspect of Seasonal Cyclicity Iranian Journal of Veterinary Medicine, № 2 (год публикации - 2026)

11. Калашников В.В., Солодова Е.В., Лебедева Л.Ф. Схема применения препарата Прогестамаг для поддержания уровня прогестерона в сыворотке крови жерёбых кобыл Ветеринария, №10, С 48-52 (год публикации - 2024)
0.30896/0042-4846.2024.27.10.48-52

12. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Солодова Е.В., Баковецкая О.В. Прогностическая оценка качества ооцитов у кобыл, использующихся в программах ВРТ, по биохимическим показателям фолликулярной жидкости и сыворотки крови Международный вестник ветеринарии, №2, С 285-297 (год публикации - 2024)
10.52419/issn2072-2419.2024.2.285

13. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Баковецкая О.В., Солодова Е.В., Терехина А.А. Оценка степени зрелости ооцитов у кобыл по соотношению стероидных гормонов в фолликулярной жидкости и крови КОНЕВОДСТВО И КОННЫЙ СПОРТ, №1, С 13-17 (год публикации - 2024)
10.25727/HS.2024.1.60251

14. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Солодова Е.В., Красильникова Е.А. Применение сурфагона для индукции овуляции кобыл в циклах ВРТ Международный вестник ветеринарии, №2, С.268-275 (год публикации - 2024)
10.52419/issn2072-2419.2024.2.268

15. Калашников В.В., Зайцев А.М., Лебедева Л.Ф. Генетические ресурсы коневодства России и биотехнологические методы их сохранения КОНЕВОДСТВО И КОННЫЙ СПОРТ, №3, С. 4-9 (год публикации - 2024)
10.25727/HS.2024.3.60837

16. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Солодова Е.В., Сакаев В.А., Бородкина Е.Ю., Дубровская А.Б. Сравнительное исследование концентрации биохимических компонентов и стероидных гормонов в фолликулярной жидкости и крови кобыл в весеннем переходном периоде и в случном сезоне Международный вестник ветеринарии, N 2, С. 328-337 (год публикации - 2025)
10.52419/issn2072-2419.2025.2.328

17. Лебедева Л.Ф., Калашников В.В., Баковецкая О.В., Терехина А.А., Солодова Е.В., Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В. РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В КОНЕВОДСТВЕ (ОБЗОР) КОНЕВОДСТВО И КОННЫЙ СПОРТ, N 1, С. 4-8 (год публикации - 2025)
10.25727/HS.2025.1.60100

18. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Баковецкая О.В., Терехина А.А., Солодова Е.В., Абаленихина Ю.В., Щулькин А.В. ОСОБЕННОСТИ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО СТАТУСА ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ КОБЫЛ В ПРОЦЕССЕ ФОЛЛИКУЛОГЕНЕЗА Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, V.17, №4, P.155-181 (год публикации - 2025)
10.12731/2658-6649-2025-17-4-1219

19. Солодова Е.В. Сакаев В.А., Лебедева Л.Ф. Разные методы подготовки свежеразбавленной и заморожено – оттаянной спермы жеребцов для использования в ИКСИ или ЭКО технологиях Ветеринария (год публикации - 2026)

20. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Солодова Е.В., Баковецкая О.В. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ РЕПРОДУКТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В КОНЕВОДСТВЕ Аграрная наука – сельскохозяйственному производству СНГ и BRICS: сб. науч. докл. XXVII Междунар. науч.-практ. форума (Бишкек, 27 сентября 2024 г.) , С. (год публикации - 2025)

21. Калашников В.В., Лебедева Л.Ф., Солодова Е.В., Баковецкая О.В. , Терехина А.А. Фолликулярная жидкость кобыл (Equus Caballus) как биологическая среда для развития ооцита in Vitro Сборник докладов V Всероссийской конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Естественнонаучные основы медико-биологических знаний», С. 63-66 (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Современные репродуктивные биотехнологии открывают новые возможности в разведении сельскохозяйственных животных путем кардинального ускорения селекционного процесса за счет производства in vitro эмбрионов от генетически ценных особей. Новейшие методы в репродукции лошадей крайне востребованы в связи с сокращением генетического разнообразия в породах, проблемой сохранения исчезающих и малочисленных пород лошадей, потребностями рынка в массовом увеличении качественного конского поголовья, в том числе спортивного, племенного и продуктивного направлений. Лошадь является наиболее дорогостоящим видом сельскохозяйственных животных с самым длинным циклом воспроизводства (жеребость - 11 месяцев), поэтому именно в коневодстве крайне актуальным является развитие и практическое внедрение репродуктивных биотехнологий для скорейшего повышения количественного и качественного состава лошадей в отечественном коннозаводстве. Проект направлен на создание первой в РФ научно-практической базы по производству эмбрионов лошадей методами ЭКО/ICSI/клонирования. В 2024 году определены режимы использования кобыл-доноров ооцитов в программах ВРТ, выверены протоколы подготовки и послеоперационного ухода за кобылами при проведении интравагинальной аспирации ооцитов из яичников (OPU). Выполнено 52 процедуры OPU с результативностью 64,4% извлечения ооцитов из фолликулов кобыл. Отработаны этапы выдержки и дозревания ооцитов до стадии МII. Достигнут уровень созревания ооцитов - 70%. Разработан протокол поэтапной подготовки спермы жеребцов к оплодотворению ооцитов кобыл in vitro. Налажено приготовление авторских сред. Определены: оптимальное время, температурный режим, кратность разведения, техника отбора наиболее качественных сперматозоидов методом всплытия, ресуспендирования и эквилибрации для ICSI. Достигнуты положительные результаты (подвижность ≥20%) в опытах по предварительной длительной инкубации (22 часа при 38,2'С) отобранных методом всплытия сперматозоидов из свежеполученной спермы жеребцов для проведения ЭКО. Освоена методика определения подвижности и жизнеспособности сперматозоидов с помощью программы Аргус-CASA («Аргус-софт Аргус-CASA», Санкт-Петербург). Апробирован краситель эозин-нигрозин для морфологической оценки сперматозоидов, позволяющий идентифицировать живые и мертвые сперматозоиды. Отработан протокол подготовки извлеченных с помощью процедуры OPU ооцит-кумулюсных комплексов лошадей к оплодотворению in vitro, включающий временной, температурный и газовый режимы выдержки, созревания, денудации и качественной оценки ооцитов. Определены морфологические критерии качества и степени зрелости ооцитов. Отработаны навыки работы на микроманипуляторе с половыми клетками лошадей и самостоятельного проведения процедуры ICSI. Результат оплодотворения зрелых ооцитов кобыл методом ICSI подтвержден фактом дробления 80% (4/5) полученных эмбрионов на стадии 5-16 бластомеров. Проводится комплексное исследование биохимического, гормонального и антиоксидантного состава фолликулярной жидкости (ФЖ) кобыл. Получены новые данные о корреляционных связях между различными элементами в ФЖ и в сыворотке крови, которые можно использовать для оценки и прогноза качества ооцитов в программах ВРТ, а также для выбора ФЖ в качестве добавки к культуральным средам. Показано положительное влияние ФЖ на уровень созревания ооцитов in vitro. Опубликовано 8 работ в рецензируемых российских и зарубежных изданиях. Принято участие в 7 всероссийских и международных конференциях с очными, в том числе 2 пленарными докладами.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Получение выдающихся, генетически ценных лошадей в племенном, спортивном, продуктивном коневодстве всегда было и остается целью их разведения. С развитием современных репродуктивных технологий появились способы кардинального ускорения селекционного процесса с неограниченным потенциалом возможностей при работе с наследственным биологическим материалом, вплоть до восстановления исчезающих пород и утраченных ценных особей. Этому призваны содействовать создаваемые в рамках федеральной научно-технической программы биоколлекции генетических ресурсов сельскохозяйственных животных, в число которых входит биоресурсная коллекция ФГБНУ "ВНИИ коневодства им. академика В.В.Калашникова". В коневодстве, наиболее дорогостоящей отрасли с самым продолжительным периодом смены поколений животных, интенсификация репродуктивного цикла является актуальной задачей. Поэтому совершенствование и развитие новых биотехнологических подходов в репродукции лошадей крайне важны для повышения эффективности отрасли. Проект направлен на организацию научно-производственной базы по созданию, хранению и использованию IVP(In Vitro Produced)-эмбрионов лошадей для отечественного коневодства. В 2025 году были отработаны технологические этапы и верифицированы протоколы подготовки свежей и криоконсервированной спермы жеребцов к процедурам ЭКО и ИКСИ, усовершенствованы среды авторского приготовления для разбавления, эквилибрации спермы и оплодотворения ооцитов лошадей in vitro методами ЭКО и ИКСИ с показателями итоговой средней прогрессивной подвижности сперматозоидов на уровне 70% для свежей и 51% для криоконсервированной спермы жеребцов. Предложена существенно более дешевая, с длительным сроком использования среда (заявка на патент) в качестве альтернативы для импортной коммерческой дорогостоящей среды G-MOPS™ ("Vitrolife", Швеция). Освоена техника пьезо-ИКСИ с помощью пьезо-устройства Eppendorf (Eppendorf PiezoXpert, Германия). Проведены первые успешные опыты по оплодотворению ооцитов кобыл этим методом. Получено дробление 18 из 41 (43,9%) и 10 из 19 (52,6%) созревших ооцитов после процедуры ИКСИ и пьезо-ИКСИ, соответственно. Заморожено 4 бластоцисты, выращенные in vitro после процедуры пьезо-ИКСИ. Изучен биохимический, гормональный и антиоксидантный состав, уровень факторов апоптоза и воспаления в фолликулярной жидкости (ФЖ) кобыл. Сделано заключение, что при использовании методов иммуно-ферментного (ИФА) и иммуно-хемилюминесцентного (ИХЛА) анализа критерием выбора фолликулярной жидкости для созревания ооцитов in vitro могут служить концентрации прогестерона, тестостерона и дигидротестостерона, с учётом содержания фосфора и сывороточного железа. Показано, что ТБК-реактивные продукты и СОД являются специфическими маркерами процесса фолликулогенеза. Установлена возможность использования фолликулярной жидкости в качестве среды для созревания ооцитов in vitro (83,6% созревших ооцитов после 36 часов инкубации в 100% ФЖ), а также как добавку к среде для всплытия и ресуспензирования после центрифугирования сперматозоидов перед ЭКО (итоговая прогрессивная подвижность - 60% , через 22 часа инкубации - 20%). Отработана технология культивирования оплодотворенных in vitro яйцеклеток до стадии бластоцисты. Верифицирован состав культуральных сред, режима и сроков культивирования эмбрионов, полученных методами ИКСИ и ЭКО. В культуральной среде собственного приготовления достигнут уровень 51,6% (33/64) дробления зигот и 36,3% (12/33) формирования бластоцист в течение 8-9 дней инкубации при 38º С в атмосфере 5% О2, 90% N2 и 5% СО2. Апробированы 2 типа крионосителей для криоконсервации полученных методами ИКСИ и ЭКО эмбрионов. Методом витрификации в 0.25 мл соломинках заморожено 20 выращенных in vitro бластоцист. Подобраны инструменты, схема анестезии, методика отбора кожного образца лошадей, санация и режим транспортировки биоматериала в лабораторию, дальнейшая обработка и протоколы выделения, культивирования, пассирования клеток для получения и замораживания клеточных линий фибробластов лошадей с целью дальнейшего использования в опытах по клонированию. Было получено 10 кожных образцов от 5 опытных кобыл. После выделения и серии пассажей на 68-й день культивирования были получены и заморожены чистые культуры фибробластов. Через 4 дня после размораживания и высева клетки показали активный и устойчивый рост (50% конфлюэнтности). Получена жеребость от пересадки 9-дневной бластоцисты после оплодотворения ооцита методом ЭКО и культивирования in vitro на собственной экспериментальной базе. Жеребость у кобылы-реципиента (10 месяцев) протекает нормально. В середине февраля 2026 года ожидается выжеребка кобылы и рождение первого в России жеребенка, полученного методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Всего в опытах по оплодотворению ооцитов методами ЭКО и пьезо-ИКСИ получено 22 и заморожено 20 бластоцист. Сделано 9 очных докладов, в том числе 2 пленарных, на международных конференциях. Сделано 9 очных докладов на международных конференциях. Опубликовано 5 научных статей, приняты к публикации 2 статьи (в том числе 1 - в журнале Q2), и в стадии рассмотрения редакцией журнала (Q2) находится 1 статья. Опубликовано интервью журналу "Открывай с РНФ. Дайджест Российского научного фонда". Опубликовано интервью журналу "Открывай с РНФ. Дайджест Российского научного фонда". Подана заявка на патент (№ 2025133159 от 27.11.2025 г., Входящий № W25077227).

Публикации

Возможность практического использования результатов
Проведены пробные сессии OPU на кобылах, принадлежащих частному коневладельцу, на экспериментальной базе ВНИИ коневодства им. академика В.В. Калашникова. От двух ценных кобыл 16 и 20-летнего возраста с проблемами воспроизводства было извлечено по 4 ооцита, 3 из которых дробились после оплодотворения методами ЭКО и пьезо-ИКСИ. Одна бластоциста, полученная методом ЭКО с использованием спермы ценного жеребца, была заморожена. Данная услуга очень востребована среди российских коневладельцев, которые с нетерпением ждут возможности получать ценное потомство от выдающихся жеребцов и кобыл методом оплодотворения in vitro в отечественных репродуктивных центрах.