Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Изучение трех видов Бобовых: вавиловии прекрасной (Vavilovia formosa), вики мохнатой (Vicia villosa) и гороха посевного (Pisum sativum, сорт «Афганистан»), инокулированных одним штаммом Rhizobium leguminosarum bv. viciae VAF12, продемонстрировало как общие, так и видоспецифичные особенности формирования растительно-микробной поверхности взаимодействия. Для всех изученных видов Бобовых было характерно наличие арабиногалактановых белков как в клеточных стенках и стенках инфекционых нитей, так и в симбиосомах инфицированных клеток в клубеньках. Было продемонстрировано низкое содержание некоторых арабиногалактановых белков (эпитопы JIM15 и JIM8) в зрелых симбиосомах. В клубеньках вики мохнатой были выявлены видоспецифические особенности. Так, арабиногалактановый белок, меченый антителом JIM16, был обильно представлен в зрелых симбиосомах, а арабиногалактановый белок, выявляемый с помощью антитела LM2, в отличие от клубеньков вавиловии прекрасной и гороха сорта «Афганистан» в зрелых симбиосомах был практически не выявляем. Таким образом, были выявлены арабиногалактановые белки, меченные антителами JIM16 и LM2, которые могут служить маркерами симбиосом. На данном этапе проведения исследований не было выявлено аллель-специфичности локализации арабиногалактановых белков у мутантных линий SGEFix−-1 (sym40–1), SGEFix−-6 (sym40–2), RisFixU (sym33–1), SGEFix−-5 (sym33–2) и SGEFix−-2 (sym33–3) при инокуляции штаммом R. ruizarguesonis RCAM1026. Проведенные исследования по локализации арабиногалактановых белков, в частности меченого антителом JIM16, показало отсутствие «правильной» дифференцировки симбиосом у неэффективных мутантов по гену Sym40, подтверждая ранее описанное для мутантов по этому гену аномальную дифференцировку бактероидов. В свою очередь, проведенные исследования локализации и распределения пектинов выявили возможную аллель-специфичность распределения гомогалактуронанов. Так, у мутанта RisFixU (sym33–1) содержание гомогалактуронанов снижено в пользу ксилоглюканов, а у мутанта SGEFix−-5 (sym33–2) выявлено появление арабиногалактанпротеин-экстенсина, меченого антителом МАС265, в дегенерирующих клетках. Завершающие исследования по анализу локализации и распределения пероксида водорода (Н2О2) в клубеньках гороха дикого типа и неэффективных мутантов позволило выявить динамику накопления перекиси водорода и закономерности ее локализации в различных зонах клубенька. Полученные результаты хорошо согласуются с ранее предложенной ролью перекиси водорода в росте инфекционной нити через ее связь с увеличением жесткости стенки инфекционной нити. Также была предложена роль перекиси водорода в созревании клеточной стенки инфицированных клеток в процессе их дифференциации. Выявленное интенсивное накопление перекиси водорода в клубеньках симбиотических мутантов гороха отражает активацию защитных реакций и окислительного стресса при развитии неэффективного симбиоза. Для более полного изучения «нового» микросимбионта гороха — R. laguerreae были проведены полногеномное секвенирование шести штаммов AMPS и их филогенетический анализ. Изучение клубеньков гороха при инокуляции штаммами AMPS показало наличие особенностей формирования растительно-микробной поверхности взаимодействия в зависимости от демонстрируемого фенотипа и степени развития ризобиальной инфекции. Было продемонстрировано наличие арабиногалактановых белков (эпитопы JIM16 и JIM20) в клубеньках, сформированных штаммом R. laguerreae AMPS05 и показано, с одной стороны, сходное мечение с клубеньками, сформированными штаммом R. leguminosarum bv. viciae 3841, а, с другой стороны, отличие от клубеньков, сформированных штаммом R. ruizarguesonis RCAM1026, что доказывает некоторую штаммоспецифичность формирования растительно-микробной поверхности взаимодействия. При исследовании другого арабиногалактанового белка, выявляемого с помощью антитела LM2, была также продемонстрирована штаммоспецифичность, которая, по нашему мнению, прежде всего зависит от степени дифференцировки бактерий в бактероиды, развития ризобиальной инфекции и защитных реакций, т. к. арабиногалактановые белки, в первую очередь, являются маркерами дифференцировки симбиосом. Кроме того, структура клубеньков и их эффективность динамичны и подвержены изменениям под действием неблагоприятных факторов внешней среды. Такие изменения затрагивают и тонкие модификации симбиотической поверхности взаимодействия, определяющей успешность коммуникации партнеров. Ранее нами с помощью лазерной микродиссекции с последующим анализом РНК-секвенирования было проведено транскриптомное профилирование в ранней зоне инфекции, поздней зоне инфекции и зоне фиксации азота в клубеньках гороха дикого типа линии SGE. В результате был получен список функциональных групп дифференциально экспрессируемых генов в разных гистологических зонах клубеньков. Проведенный в этом году анализ показал, что среди меняющих свою экспрессию в зависимости от степени дифференцировки клетки клубенька генов было выявлено 114, кодирующих активные в отношении углеводов ферменты и имеющих внеклеточную локализацию. Это были в основном гликозилгидролазы, пектинэстеразы и полигалактуроназы. Данные результаты показывают, что основные процессы, связанные с изменением клеточной стенки, происходят на ранних стадиях дифференцировки инфицированных клеток клубенька гороха.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В текущем году план реализации проекта был полностью выполнен. Также были проведены незапланированные исследования, дополняющие запланированные. Эти исследования связаны с вовлечением еще одного вида – важнейшей бобовой культуры сои культурной, детальным анализом формирования клубеньков при инокуляции разными штаммами у реликтового бобового вавиловии прекрасной, а также проведение транскриптомного анализа неэффективных клубеньков, индуцированных штаммом Rhizobium laguerreae AMPS04, наряду с анализом эффективных клубеньков штамма AMPS05. Были выявлены сортоспецифичные признаки формирования растительно-микробной поверхности взаимодействия разных генотипов гороха посевного с эффективным штаммом ризобий. Так, у сорта Frisson отсутствовал высокометилэтерифицированный гомогалактуронан в клеточных стенках инфицированных клеток, у сорта Finale в клеточных стенках отсутствовал высокометил- и деэтерифицированный гомогалактуронан, а также фукозилированный ксилоглюкан. У сорта Sparkle отсутствовала линейная галактановая боковая цепь рамногалактуронана I в стенках инфекционных нитей, фукозилированный ксилоглюкан в клеточных стенках и арабиногалактанпротеин-экстенсин накапливался в межклеточном пространстве. У сорта Rondo отсутствовал нефукозилированный ксилоглюкан в клеточных стенках. Дальнейшие исследования должны выявить значимость выявленных различий для становления и функционирования эффективного симбиоза. Было показано, что существует определенная специфичность при формировании растительно-микробной поверхности взаимодействия у сои уссурийской и солодки уральской, определяемая влиянием микросимбионта. Особенно обращает на себя внимание уникальная локализация различных форм ксилоглюкана в клубеньках сои уссурийской при инокуляции штаммом Bradyrhizobium japonicum RCAM2490. У растений солодки уральской в зависимости от штамма, индуцировавшего формирование клубеньков, различалась локализация разветвленной 1,6-галактозильно замещенной формы рамногалактуронана I и арабиногалактанового белка, реагирующего с антителом LM2. Так, при инокуляции штаммом Mesorhizobium sp. RCAM3120 эта форма пектина отсутствовала, а арабиногалактановый белок присутствовал только в стенках меристематических и неинфицированных клеток в зоне азотфиксации. При инокуляции штаммом Bradyrhizobium sp. RCAM3115 разветвленная форма пектина и арабиногалактановый белок локализовались на симбиосомных мембранах. Вне рамок плана проведен детальный морфологический анализ клубеньков вавиловии (Vavilovia formosa (Steven) Fed.), индуцированных штаммами Rhizobium ruizarguesonis RCAM1026, R. leguminosarum sv. viciae TOM, а также штаммами R. leguminosarum sv. viciae Vaf-12 и Vaf-108, выделенными из клубеньков растений дикого типа V. formosa. Выявлены морфологические особенности формируемых клубеньков. Обращает внимание дифференцировка аномальных бактероидов, которые выбрасываются в вакуоль в клубеньках вавиловии, индуцированных штаммом TOM. Ранее такая аномалия никогда не была описана в исследованиях бобово-ризобиального симбиоза. В проанализированных клубеньках, инокулированных штаммом Rhizobium laguerreae AMPS04, по сравнению с клубеньками, инокулированными штаммом AMPS05, было обнаружено 2737 генов, значимо повышающих экспрессию, в то время как 1334 гена экспрессию значимо снижали. При инокуляции штаммом AMPS04 по сравнению с инокуляцией штаммом AMPS05 повышали свою экспрессию группы генов, вовлеченные в процессы ранней инфекции и, особенно, участвующие в негативной регуляции образования клубеньков. Среди кластеров генов, которые значительно снижали свою экспрессию при инокуляции штаммом AMPS04 по сравнению с инокуляцией штаммом AMPS05, были идентифицированы гены гистонов, леггемоглобин-подобных белков, циклинов и участвующие в модификации клеточных стенок гены полигалактуроназ и пектинэстераз. В совокупности полученные данные указывают на активацию сильных защитных реакций в неэффективных клубеньках при инокуляции растений гороха штаммом R. laguerreae AMPS04 по сравнению с эффективным штаммом AMPS05. Таким образом, выявленные различия в формировании растительно-микробной поверхности взаимодействия при формировании клубеньков у разных бобовых культур, связанные с генотипом как растения, так и ризобий открывают дальнейшие перспективы выявления ассоциации определенных цитологических маркеров эффективности и неэффективности бобово-ризобиального симбиоза.