Механизмы регуляции остеогенной дифференцировки в норме и при сердечно-сосудистой патологии

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 23-15-00320

НазваниеМеханизмы регуляции остеогенной дифференцировки в норме и при сердечно-сосудистой патологии

Руководитель Малашичева Анна Борисовна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук , г Санкт-Петербург

Конкурс №80 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слова остеогенная дифференцировка, кальцификация, Notch

Код ГРНТИ76.03.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект направлен на углубленное исследование механизмов регуляции остеогенной дифференцировки клеток с целью понимания возможностей управления этой дифференцировкой при патологической кальцификации тканей сердца и сосудов. Заболевания сердечно-сосудистой системы являются ведущей причиной заболеваемости и смертности. Кальцификация тканей сердца и сосудов, в первую очередь аортального клапана, – это одна из наиболее распространенных форм хронических сердечно-сосудистых заболеваний. Единственный существующий метод лечения аортального стеноза – это хирургическая замена клапана. Однако, из-за увеличения риска заболевания с возрастом, примерно половина пациентов, требующих замены клапана, имеют противопоказания для хирургического вмешательства. Одна из причин отсутствия медикаментозной терапии аортального стеноза. заключается в том, что фундаментальные представления о механизмах эктопической кальцификации все еще активно развиваются. Известно, что в эктопическую кальцификацию вовлечены сигнальные каскады, участвующие в нормальных процессах развития сердечно-сосудистой системы и костной ткани. В первую очередь, это сигнальные каскады WNT, BMP, Notch и транскрипционный фактор Runx2, считающийся мастер-геном остеогенной дифференцировки. Ранее коллективом была показана ведущая роль взаимодействия эндотелиальных клеток с интерстициальными клетками аортального клапана в индукции патологической остеогенной дифференцировки при кальцификации аортального клапана. Полученные данные указывают на то, что при аортальном стенозе происходит нарушение регуляции сигнального пути Notch в эндотелии, которое вносит вклад в нарушение гомеостаза аортального клапана и, в конечном итоге, приводит к остеогенной дифференцировке интерстициальных клеток клапана, кальцификации и аортальному стенозу. Тем не менее, механизмы, за счет которых нарушения сигнального пути Notch в эндотелии приводят к остеогенной дифференцировке интерстициальных клеток клапана, все еще остаются неясными. Представляемый проект сфокусирован на изучении молекулярных механизмов, участвующих в регуляции остеогенной дифференцировки, включая эффекты сигнального пути Notch и других связанных сигнальных механизмов. Будет проанализировано взаимодействие эндотелиальных и мезенхимных клеток (остеобластов, интерстициальных клеток аортального клапана и других МСК) при индукции остеогенной дифференцировки; влияние активации и подавления активности различных компонентов Notch в эндотелиальных клетках на остеогенную дифференцировку. Будет проанализировано взаимодействие компонентов Notch с другими сигнальными каскадами, в частности, будет продолжено начатое ранее изучение взаимодействия сигнального пути Notch и гена Runx2. Будет проведен анализ белков, взаимодействующих с активированными доменами Notch, что позволит сделать выводы о белках, непосредственно взаимодействующих с внутриклеточными сигнальными доменами Notch в ходе остеогенной дифференцировки. На основании результатов предыдущих исследований, продемонстрировавших важность эстрогенового рецептора альфа (ERRalpha) в патологической дифференцировке интерстициальных клеток аортального клапана, будет проведено исследование роли ERRalpha в остеогенной дифференцировке. Запланированные исследования, как мы полагаем, позволят углубить понимание механизмов регуляции остеогенной дифференцировки при патологической кальцификации тканей сердца и сосудов и в норме при дифференцировке остеобластов, что, в свою очередь, может служить основной для поиска способов управления остеогенной дифференцировкой как при патологической кальцификации, когда такую дифференцировку нужно подавить, так и в ситуациях остеосинтеза, когда необходимо усиление остеогенной дифференцировки.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Переплетчикова Д.А., Басович Л.С., Кучур П.Д., Азаркина К.Е., Смирнова Д.В., Боярская Н.В., Карелкин В.В., Малашичева А.Б. Сложное взаимодействие между эндотелиальными клетками и остеобластами во время остеогенной дифференцировки Морфология. Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине; Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2024г. – СПб: Эко-Вектор, 2024. – 752-753 с (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.17816/morph.konf2024

2. Переплетчикова Д.А., Малашичева А.Б. Communication between endothelial cells and osteoblasts in regulation of bone homeostasis: Notch players Stem Cell Research and Therapy, V.16. №1. P.56. (год публикации - 2025)
10.1186/s13287-025-04176-x

3. Малашичева А.Б. Inflammation and Adipocyte Metabolism in Calcific Aortic Valve Stenosis JACC: Basic to translational science, vol. 10, №6, P. 742-744 (год публикации - 2025)
10.1016/j.jacbts.2025.03.016

4. Азаркина К.Е., Громова Е.С., Малашичева А.Б. “A Friend Among Strangers” or the Ambiguous Roles of Runx2 BIOMOLECULES, 14(11):1392. (год публикации - 2024)
10.3390/biom14111392

5. Эвенсен Д.С., Смирнова Д.В., Беляева А.А., Боярская Н.В., Успенский В.Е., Сега Ф.В.Д., Риццо П., Малашичева А.Б. Notch Signaling as a Way to Control the Endothelial-To-Mesenchymal Transition Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology, V.61. №1. P. 313–326 (год публикации - 2025)
10.1134/S0022093025050199

6. Лобов А., Кучур П., Боярская Н., Переплетчикова Д., Тараскин И., Ивашкин А., Костина Д., Хворова И., Успенский В., Репкин Е., Денисов Е., Геращенко Т., Тихилов Р., Божкова С., Карелкин В., Ванг С., Ху К., Малашичева А. Similar, but not the same: multi-omics comparison of human valve interstitial cells and osteoblast osteogenic differentiation expanded with an estimation of data-dependent and data-independent PASEF proteomic GIGASCIENCE, Volume 14 (год публикации - 2024)
10.1093/gigascience/giae110

7. Громова Е. С., Азаркина К. Е., Костина Д. А., Переплетчикова Д. А., Смирнова Д. С., Малашичева А. Б. Исследование динамики активации Runx2 при индукции остеогенной дифференцировки ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МЕДИЦИНА, 11 (3): 284-293 (год публикации - 2024)
10.18705/2311-4495-2024-11-3-284-293

8. Громова Е.С., Переплетчикова Д.А., Карелкин В.В., Малашичева А.Б. Влияние динамических изменений уровня транскрипционного фактора Runx2 на остеогенную дифференцировку клеток и сигнальный путь Notch Морфология. Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине; Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2024г. – СПб: Эко-Вектор, 2024. – 248-249 с. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.17816/morph.konf2024

9. Ныров В.А., Смирнова Д.В., Малашичева А.Б. Влияние регуляции экспрессии ESRRa на остеогенную дифференцировку клеток мезенхимного происхождения Морфология. Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине; Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2024г. – СПб: Эко-Вектор, 2024. – 711-712 с. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.17816/morph.konf2024

10. Басович Л.С., Переплетчикова Д.А., Карелкин В.В., Малашичева А.Б. Регулирование остеогенной дифференцировки мезенхимных стволовых клеток путем модификации уровня экспрессии компонентов сигнального пути Notch Морфология. Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине; Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2024 г. – СПб: Эко-Вектор, 2024. – 102-103 с. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.17816/morph.konf2024

11. Смирнова Д.В., Ныров В.А., Сафарова Д.Д., Малашичева А.Б. Роль фактора механотрансдукции KLF4 в поддержании функциональных свойств эндотелиальных клеток Морфология. Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине; Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2024г. – СПб: Эко-Вектор, 2024 – 923-923 с (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.17816/morph.konf2024

12. Сафарова Д.Д., Смирнова Д.В., Переплетчикова Д.А., Карагяур М.Н., Малашичева А.Б. Иммортализация гингивальных фибробластов человека: получение стабильных клеточных линий Морфология. Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине; Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2024г. – СПб: Эко-Вектор, 2024. – 884-885 с. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.17816/morph.konf2024

13. Азаркина К.Е., Божокин М.С., Переплетчикова Д.А., Малашичева А.Б. Влияние сигнального пути Notch на хондрогенную дифференцировку человеческих остеобластов Морфология. Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине, Материалы VI Национального конгресса по регенеративной медицине; Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2024 г. – СПб: Эко-Вектор, 2024. – 43-44 с. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.17816/morph.konf2024

14. Переплетчикова Д.А., Басович Л.С., Лобов А.А., Азаркина К.Е., Кучур П.Д., Хворова И.А., Карелкин В.В., Малашичева А.Б. Клеточные и молекулярные механизмы взаимодействия эндотелиальных клеток с клетками мезенхимного происхождения в остеогенной дифференцировке Астерион. Материалы XI Молодежной школы-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, Материалы XI Молодежной школы-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-18 октября 2024 г. – СПб.: Астерион, 2024. – 259-260 с. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.53115/9785001885320

15. Басович Л.С., Карелкин В.В., Малашичева А.Б. Влияние баланса активации сигнального пути Notch на остеогенную дифференцировку клеток мезенхимного происхождения Астерион. Материалы XI Молодежной школы-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, Материалы XI Молодежной школы-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-18 октября 2024 г. – СПб.: Астерион, 2024. – 227-228 с. (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.53115/9785001885320.

16. Переплетчикова Д., Кучур П., Басович Л., Хворова И., Лобов А., Азаркина К., Аксенов Н., Божкова С., Карелкин В., Малашичева А. Endothelial-mesenchymal crosstalk drives osteogenic differentiation of human osteoblasts through Notch signaling Cell Communication and Signaling, V. 23. №1. P.100 (год публикации - 2025)
10.1186/s12964-025-02096-0

17. Переплетчикова Д.А., Азаркина К.Е., Смирнова Д.В., Семенихин В.А., Малашичева А.Б. Notch-сигнальный путь как механизм регуляции остеогенной дифференцировки Регенерация органов и тканей (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект направлен на углубленное исследование механизмов регуляции остеогенной дифференцировки клеток с целью понимания возможностей управления этой дифференцировкой при патологической кальцификации тканей сердца и сосудов. Проект сфокусирован на изучении молекулярных механизмов, участвующих в регуляции остеогенной дифференцировки in vitro, включая эффекты сигнального пути Notch и других связанных сигнальных механизмов. Задачами этапа являлись: исследование роли стабилизации Runx2 в клетках в условиях остеогенной дифференцировки на активность промотора RUNX2 и последующую дифференцировку; эксперименты с дозировкой компонентов сигнального пути Notch и гена RUNX2 в условиях остеогенной дифференцировки клеток; исследование ранней активации Runx2 в ходе остеогенной дифференцировки клеток; получение рекомбинантного белка для характеристики интерактома внутриклеточных доменов Notch; эксперименты по оценке влияния ERRalphpa, Klf2 и Klf4 на остеогенную дифференцировку интерстициальных клеток аортального клапана и на дифференцировку остеобластов. Исследование роли Runx2 и Notch в профибротической трансформации клеток: исследование механизмов, посредством которых происходит подавление остеогенной дифференцировки клеток в экспериментах по сокультивированию эндотелиальных клеток с модифицированным Notch. Продемонстрировано дозозависимое влияние Notch на остеогенную дифференцировку различных типов клеток. Показано, что низкие уровни активации NICD1 усиливают остеогенную дифференцировку, а избыточный уровень NICD1 подавляет остеогенную дифференцировку; не обнаружено дозозависимого эффекта для RUNX2. Из полученных к настоящему моменту данных следует, что для индукции остеогенной дифференцировки остеобластов in vitro необходимо кратковременное падение уровня белка Runx2, а предотвращение этого процесса приводит к угнетению остеогенной дифференцировки, и при этом существует тонкая настройка и регулирование экспрессии гена RUNX2. В части характеристики интерактома Notch получены необходимые промежуточные генетические конструкции и разработан дальнейший дизайн исследования. Продолжено исследование влияния ERRalpha на остеогенную дифференцировку клеток. Определено, что увеличение экспрессии ESRRA в интерстициальных клетках аортального клапана приводит к увеличению степени минерализации, что соответствует ранее показанным результатам для остеобластов. Однако изменения ERRa не оказали существенного влияния на минерализацию МСК эндометрия, характеризующихся высоким уровнем базовой экспрессии ERRalpha. Активация ERRalpha не повлияла на экспрессию мРНК RUNX2 в эндМСК, при этом наблюдали резкое увеличение экспрессии RUNX2 в интерстициальных клетках клапана, что указывает на уникальную роль ERRa в патологической кальцификации. Изменения в уровнях экспрессии ESRRA как в эндМСК, так и в ИКК коррелировали с изменениями экспрессии компонентов Notch. Повышенная экспрессия ERRa снижала уровень экспрессии эндотелиальных маркеров в HUVEC, что указывает на роль ERRa в модулировании фенотипа эндотелиальных клеток. Для исследования транскрипционной активности ERRaplhpa разработана лентивирусная би-флуоресцентная репортерная плазмида, содержащая расположенный перед геном GFP промотор, связанный с находящимся перед ним специфическим сайтом связывания транскрипционного фактора. На модели фибробластов человека показано, что при взаимодействии Runx2 и Notch экспрессия нижележащих мишеней зависит от дозы Notch и может изменяться как в сторону ингибирования экспрессии, так и в сторону активации в зависимости от дозы Notch. Получены экспериментальные подтверждения того, что подавление гена KLF4 связано с сигнальным путём Notch и его компонентами, а также данные о существенной роли фактора KLF4 в эндотелиальных клетках при регуляции остеогенной дифференцировки. Определено, какие изменения в эндотелиальных клетках, возникающие в результате инактивации/активации сигнального пути Notch, влияют на остеогенную дифференцировку остеобластов. Проанализированы транскриптомные профили эндотелиальных клеток, модифицированных NICD1/NICD3 и shNOTCH1 и shNOTCH3 и определены ключевые изменения экспрессии генов. Идентифицирован набор генов, которые демонстрируют чувствительный транскрипционный профиль к модуляции передачи сигналов Notch в обоих направлениях. Эти результаты дают представление о механизмах, с помощью которых передача сигналов Notch в эндотелиальных клетках может влиять на остеогенез. Показано, что кондиционированная среда от эндотелиальных клеток снижает минерализацию матрикса остеобластов, но не полностью подавляет остеогенную дифференцировку, предположительно, из-за отсутствия постоянного воздействия высоких доз NO. Обнаружена линейная зависимость между дозой NO и кальцификацией матрикса, подтверждающая ингибирующий эффект NO на остеогенез. Для стандартизации последующих экспериментов получена иммортализованная клеточная линия гингивальных фибробластов человека путем гиперэкспрессии теломеразы. С целью дальнейшего изучения механизмов влияния эндотелиальных клеток на процессы физиологической и патологической остеогенной дифференцировки получены и охарактеризованы эндотелиальные клетки из индуцированных плюрипотентных клеток. В рамках расширения исследования роли Notch в процессах, связанных с остеогенной дифференцировкой, показано, что активация Notch нарушает нормальную хондрогенную дифференцировку МСК человека. В завершающий год выполнения проекта запланированы дальнейшие экcперименты по уточнению роли взаимодействия сигнального пути Notch и Runx2 в определении остеогенной трансформации клеток.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Проект направлен на углубленное исследование механизмов регуляции остеогенной дифференцировки клеток с целью понимания возможностей управления этой дифференцировкой при нормальной и патологической кальцификации тканей. Проект сфокусирован на изучении молекулярных механизмов, участвующих в регуляции остеогенной дифференцировки, включая эффекты сигнального пути Notch и других связанных сигнальных механизмов. Задачами этапа являлись: исследование механизмов взаимодействия Runx2 и Notch (анализ данных секвенирования хроматина (CHP-seq), ассоциированного с RUNX2), получение рекомбинантных белков NICD1, RBPJ и RUNX2 для характеристики интерактома, анализ влияния ERRalpha и Klf2/Klf4 на остеогенную дифференцировку, исследование роли Runx2 и Notch в профибротической трансформации клеток, анализ влияния эндотелиальных клеток, в том числе эндотелиальных производных иПСК на остеогенную дифференцировку мезенхимных клеток различного происхождения. При анализе данных ChIP-seq установлено, что RUNX2 связывается с геном SMAD3 и другими компонентами TGF-β-пути, а также с коактиваторами Notch факторами MAML1/2, что указывает на опосредованное влияние RUNX2 на Notch и регуляцию TGF-β-зависимых программ в остеобластах. Созданы и охарактеризованы конструкции NICD1, RBPJ и RUNX2, синтез полноразмерного NICD1 достигнут, но очистка белков требует дальнейшей оптимизации. Продолжено исследование влияния ERRalpha на остеогенную дифференцировку клеток. При сокультивировании остеобластов/интерстициальных клеток клапана с эндотелиальными клетками определено, что активация ERRalpha в эндотелиальных клетках не влияет на остеогенную дифференцировку остеобластов/интерстициальных клеток клапана, тогда как подавление ESRRA в эндотелии вызывает гибель обеих популяций, что связано с нарушением в них митохондриальных и метаболических процессов. Продолжено исследование влияния Klf2/Klf4 на остеогенную дифференцировку остеобластов и интерстициальных клеток клапана. Разработаны и верифицированы инструменты для подавления и активации экспрессии KLF2 и KLF4. Определено, что при сокультивировании остеобластов/интерстициальных клеток клапана с эндотелиальными клетками оверэкспрессирующими KLF2/4 снижается остеогенный потенциал мезенхимных клеток, тогда как их подавление в эндотелии не оказывает существенного эффекта. Показано, что оверэкспрессия KLF2/4 в эндотелиальных клетках сопровождается повышением экспрессии эндотелиальных маркеров, снижением активности компонентов сигнального пути TGF-β и модуляцией Notch. Продемонстрировано комплексное влияние RUNX2 и Notch на передачу сигнала TGF-β1 в контексте фибротической трансформации, а также, определено, что TGF-β1 способен активировать гены каскада Notch по неканоническому пути, что, в свою очередь влияет как на RUNX2, так и гены TGF-β1 сигналинга. В ходе проекта получены стабильные иммортализованные линии первичных остеобластов на основе сверхэкспрессии hTERT и проведена их валидация. Доказано сохранение специфического клеточного фенотипа после иммортализации, а также подтверждена геномная стабильность и отсутствие сенесценции. С использованием иммортализованных остеобластов определено, что активация экспрессии RUNX2 при остеогенном стимуле имеет сложную динамику; получены доказательства вовлеченности Notch в активацию зависимых от RUNX2 ранних этапов остеогенной дифференцировки. Установлено, что эндотелиальные клетки, включая эндотелиальные производные от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, при прямом сокультивировании способствуют кальцификации внеклеточного матрикса клеток мезенхимного типа вне зависимости от их тканевого происхождения. Показано, что совместное действие NICD1 и TGF-β1 усиливает остеогенную дифференцировку клеток мезенхимного происхождения в дозозависимом режиме, тогда как отдельные компоненты оказывают меньшее влияние.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Сформирован научный задел, выявивший молекулярные мишени, при помощи которых возможно модулирование остеогенной дифференцировки клеток человека in vitro. Управление этими мишенями представляет перспективный терапевтический интсрумент в отношении активации остеогенной дифференцировки для стимуляции регенерации костной ткани, что в частности чрезвычайно актуально при заживлении кртических костных дефектов. Подавление остеогенной дифференцировки также актуально в случаях патологической кальцификации, в частности при кальцификации сосудов и тканей аортального клапана. Этот задел будет использован в дальнейших разработках, направленных на терапию указанных состояний.